Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспалительных биодизазы о язвенный колит и болезнь Крона. Основным преимуществом этой методики является то, что она может быть использована для оценки первого анти- и проинфамматорного воздействия сигнальных белков. Смысл этого метода расширяет обследование газа в новых достижений и воспаления.
Хотя этот метод может обеспечить понимание генетического воздействия на воспаление кишечника. Он также может быть применен к другим факторам, таким как диеты и микробиом. Как правило, лица, новые в этом семестре будет бороться, потому что обработка рубцовой ткани болезни сложно.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как вскрытие и шаги подготовки ткани трудно узнать, потому что мистика и структуры клеточной ткани могут быть изменены. Чтобы вызвать декстран сульфат натрия, или DDS колит, заменить обычную питьевую воду с 3%DSS раствор, добавить либидий в течение семи дней. Измерение массы тела каждой мыши, потребление раствора DSS и ежедневное производство стула.
В конце семидневного лечения поместите мышь в положение на спине и используйте маленькие ножницы, чтобы сделать три сантиметра длиной среднего разреза в брюшной полости. Урожай селезенки и измерить ее размер. Затем используйте типсы, чтобы поднять толстую кишку, чтобы она была отделена от окружающей мезентерии.
И извлекайте всю толстую кишку до тех пор, пока не будут видны цикум и прямая кишка. Переложить ткань на колонозное поле. И глубоко внутри таза, чтобы освободить проксимальной и дистальной толстой кишки, соответственно.
Измерьте и замитьте длину изолированной толстой кишки. И использовать 10 миллилитров шприц оснащен иглой gavage промыть толстой кишки с 10 миллилитров ледяной PBS для удаления кала и крови, покаиллюат работает ясно. Для гистологической идентификации разделите образцы тканей на проксимальные, средние и дистальные секции одинакового размера.
И исправить ткани в 4%paraformaldehyde ночь при 4 градусах по Цельсию. Для гематоксилина и эозина окрашивания изолированной ткани толстой кишки, на следующее утро, погрузить части ткани в 30% сахарозы и PBS ночь в отдельных 15 миллилитров труб для криозащиты образцов. На следующий день, встраиваемые ткани в оптимальной температуре резки или OCT соединения.
И охладить ткани в минус 20 градусов по Цельсию до OCT затвердевает. Поместите блоки OCT в криостат и установите толщину циферблата до 12 микрометров. Затем нарежьте и соберите 12 микрометров толщиной замороженные секции на стеклянные слайды микроскопа.
Когда все ткани были секционые, тепло слайды при 65 градусов по Цельсию на горячей тарелке в течение 20 минут. И мыть нагретые секции кратко в дистиллированной воде перед окрашивание с гематоксилином окрашивания раствора в течение пяти минут. Удалите избыток гематоксилина раствора и запустить в водопроводной воде в течение пяти минут.
И дифференцировать разделы с 0,5%гидрохлорной кислоты в этаноле в течение 30 секунд, а затем одну минуту промыть под проточной водопроводной водой. Затем, мыть образцы в течение одной минуты в PBS. Затем еще пять минут мыть под проточной водопроводной водой.
В конце стирки погрузим ткани в восходящую серию этанола в течение 10 секунд за погружение. Затем счетчики в эосине в течение двух минут. Для обезвоживания образцов, погрузить слайды в 95% этанола и два изменения 100% этанола в течение пяти минут за погружение.
Затем очистка с двумя, пятью минутными изменениями в ксилене. Затем оценка повреждения тканей проксимальной, средней и дистальной толстой кишки каждой экспериментальной группы. Для иммуногистохимического анализа, после нагрева секций в течение 20 минут на горячей тарелке, мыть слайды три раза в PBS в течение 10 минут за стирку.
И устранить эндогенной пероксиды с 10 минут 3%перекиси перекиси инкубации. В конце инкубации, мыть образцы три раза в PBS, как попродемонстрировано, и блокировать любые неспецифические связывания с блокирующим буфером, по крайней мере один час при комнатной температуре. Затем замените блокирующий буфер основным коктейлем, представляющим интерес для антител.
Для ночной инкубации при 4 градусах по Цельсию. На следующее утро, аспирировать избыток первичного раствора антител и мыть слайды три раза в PBS. После последней стирки инкубировать слайды с соответствующим биотинилированным вторичным антителом коктейль.
Затем маркировка стрептавидином хрена пероксидазы комплекса при комнатной температуре. Чтобы визуализировать иммунореактивные клетки, маркировать образцы с DAB до тех пор, пока светлый или темно-коричневый цвет развивается. А счетчики с гематоксилином и 0,3%разбавляют аммиаком.
Когда слайды высохли, используйте световой микроскоп, чтобы получить яркие полевые изображения секций тканей под 10-х увеличением. И использовать программу обработки изображений для выявления и количественной оценки популяции отмеченных иммунных клеток как в эпителии, так и в ламина проприи. Для анализа экспрессии генов в обработанных DSS двоеточиях, извлекайте РНК из минус 80 градусов по Цельсию оттаяли образцы тканей толстой кишки в соответствии со стандартными протоколами извлечения РНК.
И смешать один микрограмм с общей РНК с 2,5 микролитров 20 миллимолярный олиго деокситимидин 12 до 18 грунтовки и один микролитр молони мурин лейкемии вирус обратной транскриптазы. После 60-минутной инкубации при 42 градусах Цельсия смешайте один микролитр cDNA с 0,5%microliters соответствующих вперед и обратного количественных праймеров ПЦР для цитокинов интереса и 2x флуоресцентного зеленого красителя. Затем запустите количественный ПЦР по соответствующим параметрам и вычислите относительную экспрессию генов в соответствии со стандартными протоколами.
По сравнению с дикими мышами, альфа-густдуцин нокаутом мышей проявляют более тяжелый колит с чрезмерной потерей веса, диарея и кишечные кровотечения. После семи дней DSS администрации, гистологический анализ толстой кишки разделы выявить более отягчающих повреждений тканей в проксимальной, средней и дистальной толстой кишки нокаут мышей, по сравнению с их коллегами дикого типа. Эта чрезмерная иммунная активация приводит к индукции колита с надежной инфильтрацией различных воспалительных клеток в толстой кишке животных, как это наблюдается иммуногистохимическим анализом.
Кроме того, количественный анализ ПЦР демонстрирует более высокие уровни альфа-и вывода гамма-экспрессии TNF, но более низкое выражение IL-5, 10 и 13, в нокауте по сравнению с дикорастучей мышей толстой кишки без разницы в TGF бета одно выражение наблюдается. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы оптимизировать текстурные Southvater натрия дозировка и продолжительность демонстрации. Переасыв эту процедуру, другой метод, как получение культуры может быть выполнена для того, чтобы понять дополнительные вопросы, такие как эффект воспаления в кишечных тканях происхождения.
После его развития, этот метод прокладывает путь для исследователей в области воспаления кишечника, чтобы исследовать вклад генных мутаций в тяжесть эрозии биодизазы и других позвоночных. Не забывайте, что работа с болезнью кишечника ткани и ее содержание может быть чрезвычайно опасным и последствия, такие как ношение вещей, которые являются целесообразными, личная защита постоянной всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
