Этот протокол позволяет гарантировать хорошую изоляцию внеклеточных пузырьков и уведомление о большем количестве белков EBDF. По сравнению с другими методами изоляции, это один утверждает, что это больше целостности и вертикальной деятельности. EVs изучаются все больше и больше в LC, а также патологических состояний.
Этот метод может быть применен к любым системам, которые мы выбираем для характеристики и изучения EVs. Для этого содержания или биологической этики особое внимание требуется при итерации EVs, как в культуре приводит к следующим экспериментам. Визуальная демонстрация имеет решающее значение для размещения специального оборудования, такого как самодельный размер колонки исключения хроматографии, а также участие счетчика наночастиц и масс-спектрометра.
Помочь продемонстрировать процедуру будет Антонелла Раффо-Ромеро, из лаборатории. Начните с предварительной изоляции внеклеточных пузырьков, или EVs, от состояния среднего. Перенесите состояние в культурную среду из микроглии или макрофаговых культур в коническую трубку и центрифуга в 1200 раз G в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки.
Перенесите супернатант в новую коническую трубку и центрифугу еще на 20 минут, чтобы устранить апоптотические тела. Затем перенесите супернатант в поликарбонатную трубку на 10,4 миллилитров. Поместите трубку в ротор 70,1 TI и ультра центрифугу при 100 000 раз G в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать EVs.
После центрифугации отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в 200 микролитров 0,2 микрометра фильтруемого PBS. Чтобы изолировать EVs, подготовьте самодельный столбец хроматографии размера путем мытья и стерилизации стеклянной хроматографии колонки, и размещение 60 микролитров фильтр в нижней части. Стек колонны с поперечной связи агарозы гель фильтрации базовой матрицы для создания стационарной фазы 0,6 сантиметров в диаметре и 20 сантиметров в высоту.
Затем промыть фазу с 50 миллилитров 0,2 микрометра фильтруется PBS. При необходимости храните столбец при четырех градусах Цельсия для более длительного использования. Поместите рсузированную гранулу EV поверх стационарной фазы и соберите 20 последовательных фракций из 250 микролитров, продолжая добавлять PBS в верхней части стационарной фазы.
Фракции могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для выполнения анализа слежения за наночастицами сделайте разбавление каждой фракции с 0,2 микрометра фильтруемой PBS и вихрем его для устранения агрегатов. Положите раствор в один миллилитровый шприц и поместите его в автоматический шприц-насос.
Затем отрегулируйте настройки камеры до соответствующего уровня увеличения экрана и уровня камеры и нажмите на Run. Загрузите образец в камеру анализа со скоростью вливания 1000 в течение 15 секунд. Затем уменьшите и стабилизууте скоростной поток для видеозаписи до скорости вливания 25 в течение 15 секунд.
Захват три последовательных 60 секунд видео потока частиц. Затем отрегулируйте уровень камеры и порог обнаружения перед видео-анализом. Нажмите на настройки ОК, чтобы начать анализ, и нажмите на экспорт, когда это делается.
Вымойте систему одним миллилитром 0,2 микрометра фильтруемого PBS между каждой фракцией. При проведении анализа электронной микроскопии используйте центробежный фильтр в 50 килодальтонных центробежных для концентрации процентных фракций хроматографии размера. Для извлечения белка смешайте 50 микролитров буфера RIPA с образцом EV в течение пяти минут на льду.
Sonicate образцы три раза на 500 Вт и 20 килогерц в течение пяти секунд. Затем удалите везикулярный мусор путем центрифугирования при 20 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После изоляции белков, выполнить миграцию белка в укладке гель 12%полиакрилик гель.
Смешайте белки в геле с Coomassie Blue в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем акциз каждый цветной кусок геля и разрезать его на мелкие кусочки. Положите кусочки геля через ряд последовательных моет, как описано в рукописи.
Затем высушите их полностью вакуумным концентратором. После высыхания выполняют уменьшение белка с 100 микролитров 100 миллимолярный бикарбонат аммония, содержащий 10 миллимолярный дитиотрейтол в течение одного часа при 56 градусах по Цельсию. Далее выполните белковую алкилирование со 100 микролитров 100 миллимолярный бикарбонат аммония, содержащий 50 миллимолярный идодоацетамид в течение 45 минут в темноте.
Вымойте кусочки геля в соответствии с рукописными указаниями и полностью высушите их на вакуумном концентраторе. Выполните переваривание белка с 50 микролитров трипсина в 20 миллимолярный бикарбонат аммония при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день извлекайте переваренные белки из геля с 50 микролитров 100%ACN в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, а затем 15 минут при комнатной температуре с непрерывным перемешиванием.
Затем извлекайте белки дважды с 50 микролитров 5%TFA в 20 миллимолярный бикарбонат аммония, непрерывно помешивая в течение 20 минут. Добавьте 100 микролитров ACN и продолжайте помешивать в течение 10 минут. После этого высушите белки и повторно нарисуйте их в 20 микролитров 0,1%TFA.
Desalt образец с помощью 10 микролитер пипетки отзыв с C 18 обратной фазы средств для опреснительной и концентрации пептидов. Затем утешить их ACN и 0,1% formic кислоты. Полностью высушите образец с помощью вакуумного концентратора и скопив его в 20 микролитров ACN и 0,1% formic кислоты для жидкой хроматографии тандем масс-спектрометрии, или LC-MS.
Загрузите переваренные пептиды в прибор и выполните анализ образца. Для подтверждения изоляции EV каждая фракция SCC подвергалась анализу слежения за наночастицами. Число частиц было значительно выше в фракциях пять, шесть и семь.
Эти фракции были объединяются в одну выборку 2F-EV положительные, и по сравнению с EV отрицательные фракции, 1F-EV отрицательный и 3F-EV отрицательный, используя западный анализ помарки. Результаты показали наличие белка теплового шока 90 в положительном образце EV и в контроле ликата клетки. Электронная микроскопия положительного образца EV показала EVs в диапазоне размеров около 100 нанометров и 400 нанометров.
Протеомический анализ был проведен с целью выявления загрязняющих белков в отрицательных образцах EV и характеристики содержания белка в ЭВ. Выявленные белки сравнивались между отрицательными 1F-EV и положительными образцами 2F-EV, а также между положительными и 3F-EV отрицательными образцами 2F-EV. Используя этот неконкугетный метод, пул из 536 белков был представлен в базу данных ExoCarta и привел к идентификации 86 связанных с EV белков.
Кроме того, этот пул также позволил определить белковые взаимодействия и связанные с ними биологические функции. Было установлено, что белки из положительного образца EV сыграли роль в иммунных и нейропротекторных путей. Эффекты микроглии полученных EVs были оценены на нейрит рост с PC 12 клеток и крыс первичных нейронов.
Значительное увеличение роста наблюдалось в рамках EVs по сравнению с контролем. Макрофаг полученных EVs были оценены на вторжение клеток глиомы. Было установлено, что EVs нарушения роста и вторжения глиомы сфероидов.
Самое главное помнить, чтобы действительно тщательно отказаться от supernatant ультрацентрифугации шаг, с тем чтобы предотвратить потерю EVs в этой процедуре. Мы выступаем за крупномасштабный и неконкугетный подход, чтобы сосредоточиться на целом содержании белка, а затем вертикальный эффект EVs. так что содержание нуклеиновых кислот может быть связано с помощью анализа.
При этом подходе из первичной культуры, мы можем различать белки EV и свободные белки, которые находятся вне разнообразия. Таким образом, остается вопрос, является ли эта коагуляция артефактной или, скорее, некоторые другие реальные
