В этом протоколе излагается простая подготовка к изображению AFM внеклеточных пузырьков в гидратированных и высушенных формах, их электростатическая иммобилизация, сканирование поверхности, везическая идентификация, анализ и интерпретация данных. Основным преимуществом этой техники является удобная электростатическая фиксация пузырьков на поверхности кожи и анализ поствизионных изображений с учетом искажения формы, вызванного иммобилизацией. Полученные результаты размеров пузырьков соответствуют Gold Standard CryoTEM Imaging, которая остается дорогостоящей и сложной техникой.
Если вы новый пользователь AFM, начните с характеристики сухих образцов, прежде чем переступить к гидратированных образцов. Потому что существует множество дополнительных факторов, которые могут повлиять на приобретение гидратированных образцов. Для начала изолируйте внеклеточные пузырьки из биожидких, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем прочно прикрепите диск слюды к магнитному диску образца из нержавеющей стали. Расщепляйте диск слюды с помощью острой бритвы, чтобы разоблачить новый слой материала. При комнатной температуре обработать верхнюю поверхность слюды в течение десяти секунд сотней микролитров десятимилояленного раствора хлорида никеля II.
Это изменяет заряд поверхности от отрицательного к положительному. Пятно никеля II хлорид раствор с ворсиной свободной салфетки или blotting бумаги. Затем трижды промыть поверхность слюды деионизированной водой и высушить ее потоком сухого азота.
Поместите диск образца AFM с прикрепленной поверхностью измененной слюды в чашку Петри. Затем разбавляют экзосомы PBS, чтобы получить концентрацию от четырех до сорока миллиардов частиц на миллилитр раствора. Проверить концентрацию разбавленных частиц с помощью анализа отслеживания наночастиц.
Сформирует sessile падение на поверхности слюды путем опорожнения сто микролитров разбавленного раствора экзосомы из пипетки. Затем поместите крышку на чашку Петри и запечатать его парафеновой пленкой, чтобы уменьшить испарение образца. Инкубировать в холодильнике в течение двенадцати часов.
После инкубации, аспирировать от 80 до 90 процентов образца тщательно, не нарушая поверхности. В этот момент экзосомы будут электростатически обездвижены на субстрате слюды. При визуализации гидратированных образцов, промыть поверхность три раза с PBS.
Позаботьтесь, чтобы сохранить образец гидратированных на протяжении всего процесса полоскания. После мытья поверхности слюды с PBS, удалить от 80 до 90 процентов жидкости и пипетки сорок микролитров свежего PBS для покрытия образца. Гидратированный образец готов к визуализации.
При визуализации высушенных EV's, удалить соли с поверхности путем полоскания субстрата в три раза с деионизированной водой. После аспирации как можно больше жидкости, не касаясь поверхности, высушите остальное потоком сухого азота. Для изображения высушенных внеклеточных пузырьков выберите кантилевер, предназначенный для сканирования в воздухе в режимах касания и бесконтактной визуализации, и смонтировать его на держатель зонда.
Поместите образец на сцену AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит образец на сцене. Поместите держатель зонда в AFM.
Дайте время для подготовки и стадии, чтобы уравночные термически. Используйте режим касания для сканирования области, которая составляет 5x5 микрон rastered в 512 линий со скоростью сканирования одного герца. Приобретайте изображения высоты и фазы, поскольку они предоставляют бесплатную информацию о топографии и свойствах поверхности образца.
Время сканирования будет увеличиваться с изображением области и количество линий, выбранных для формирования изображения, но уменьшается с скоростью сканирования. Поскольку скорость быстрого сканирования может повлиять на качество изображения, скорость rastering должна быть баланс между временем приобретения и качеством изображения. Для изображения гидратированных пузырьков выберите кантилевер, подходящий для сканирования мягких, увлажненых образцов, и смонтировать кантилевер на держатель зонда, предназначенный для сканирования жидкостей.
Влажный кончик кантилевера с PBS, чтобы уменьшить вероятность введения пузырьков воздуха в жидкость во время сканирования. Затем обездвижить образец на сцене AFM. После того, как образец термически equilibrates, изображение гидратированных поверхности слюды в режиме постукивания.
Приобретайте изображения высоты и фазы. Чтобы проанализировать полученные изображения, сначала перейдите в выбранные режимы SPM процесса данных, затем Tip'and выберите Модель Tip'Select геометрии и размеры наконечника, используемого для сканирования образца и нажмите OK'Correct наконечник эрозии артефактов, выполняя реконструкцию поверхности. Откройте изображение.
Из меню выберите Data Process'then select SPM Modes'followed by Tip'then выберите Surface Reconstruction'and нажмите OK'Next, выберите процесс передачи данных, а затем Level'and выберите Plane Level'to выровнять плоскость изображения и соответствовать плоскости лаборатории XY, удалив наклон в субстрате из данных сканирования. Выровнять строки в изображении, выбрав Data Process'followed by Correct Data', а затем выбрать варианты выравнивания рядов, включая медиану, которая является алгоритмом, который находит среднюю высоту каждой линии сканирования и вычитает ее из данных. Далее перейдите на Data Process'followed by Correct Data'and выберите Удалить Scars'This устранит распространенные ошибки сканирования, известные как Scars'To выровнять поверхность слюды на нулевой высоте, перейдите в меню процесса данных и выберите Flatten Base'in The Level'drop down menu.
Определите дополнительные клеточные пузырьки на отсканированной поверхности, заехав в Grains'menu и используя Mark by Threshold'This алгоритм определяет поверхностные обездвиженное экзосомы как частицы, выступающие из нулевого поверхностного субстрата по высоте выше выбранного пользователем порога. Выберите порог в диапазоне от одного до трех нанометров. Это позволит устранить большую часть задней земли помех.
Наконец, выполните геометрическую и мерную характеристику идентифицированных пузырьков с помощью доступных алгоритмов распределения, доступных из меню Зерна. Экспорт данных AFM из Gwyddion для специализированного анализа другими вычислительными инструментами и пользовательскими компьютерными программами. Модификация поверхности хлорида никеля приводит к иммобилизации дополнительных клеточных пузырьков, зависящих от времени.
Поверхностная концентрация обездвиженых пузырьков чрезмерно плотна после 24 часов инкубации, в то время как 12-часовая инкубация приводит к уменьшению количества экзосом и сканированию данных, которые легче анализировать точно. На этом изображении AFM показаны гидратированные экзосомы MCF7, электростатически обездвижено на поверхности модифицированной слюды. Соответствующее фазовое изображение AFM подтверждает, что зерна на изображении высоты являются мягкими наночастицами, как и следовало ожидать для мембранных пузырьков.
Данные о высоте трех пузырьков вдоль одной линии показаны здесь. Эти профили иллюстрируют сплющенную форму, вызванную электростатическим притяжением экзосом к положительной поверхности заряда модифицированной слюды. Искажение формы проявляется в увеличенном представлении обездвиженой везикулы и ее поперечного сечения.
Для оценки шаровых размеров экзосом в растворе, на может соответствовать объемам, заключенным поверхностной обездвиженой и сферической мембраны конвертов. Распределение размеров шаровых пузырьков в растворе было определено на основе данных AFM 561 иммобилизованных пузырьков. Размеры пузырьков на изображениях CryoTEM соответствуют результатам AFM.
Перед визуализацией hyrdrated экзосомы, важно помнить, чтобы тщательно промыть поверхность с PBS. Это позволит удалить входящие экзосомы и предотвратить их присоединение к наконечнику AFM. При визуализации высушенных экзосом, не забудьте использовать воду DI для подъема субстрата.
Мытье DI предотвратит образование кристаллов соли на поверхности по мере того как substrate высыхает. Если таковые имеются, кристаллы соли сделают обработку изображений трудной задачей.
