Поглощение глюкозы является ключом к пониманию здоровья и болезней. Поскольку глюкоза играет ключевую роль в метаболических и структурных потребностях в организме человека, а также играет жизненно важную роль в регуляции. Внеклеточное измерение глюкозы позволяет разработать высокопроизводительные анализы кинетики поглощения глюкозы в клетках, тканях и органах различного генетического фона в ответ на питательные вещества или лекарства.
Этот анализ станет ценным инструментом для открытия терапии и питания при диабете, раке, дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы, ожирении и всех заболеваниях глюкозы и обмена веществ. Анализ нуждается в корректировке времени для голодания и стимуляции, которая должна основываться на метаболической специфике для различных тканей и клеточных культур. Культивируют фибробласты мыши 3T3-L1 путем покрытия от 10 до 6 клеток, разбавленных в 20 миллилитрах среды 1 в 296 луночных пластинах.
Пластина 100 микролитров клеточной суспензии на лунку, обеспечивающая поддержание однородности этой суспензии путем перемешивания. Выращивайте клетки в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия без изменения среды до слияния примерно до 70-80%. Поддерживайте клетки сливающимися и голодающими, культивируя их в одной среде в течение 48 часов.
Варьируйте время инкубации от 24 до 72 часов в зависимости от желаемого катаболического состояния натощак. Декант среды из ячеек в 96 пластинах скважины. Впитайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
Промыть 96-луночную пластину 100 микролитрами PBS на лунку и впитать оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами. Добавьте 100 микролитров свободного от глюкозы DMEM на лунку и инкубируйте в течение 40 минут. Отрегулируйте время инкубации в зависимости от стимулов типа клеток и желаемого уровня голодания.
Используйте восемь реплик для каждого условия моделирования. Поэтому подготовьте один миллилитр для каждого условия моделирования. Используйте семь симуляционных состояний без инсулина.
Глюкоза FD 2,5 микрограмма на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 микрограмма на миллилитр и 0 миллиграмм на миллилитр в 196 пластине скважины. Используйте семь состояний стимуляции инсулином. Глюкоза FD составляет 2,5 микрограмма на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 микрограмма на миллилитр и 0 микрограмм на миллилитр в другой 96-луночной пластине.
Для подготовки условий стимуляции разводят один микролитр в пять миллиграммов на миллилитр рабочего раствора глюкозы FD и 999 микролитров DMEM без глюкозы для получения одного миллилитра рабочего раствора. Используя этот рабочий раствор, приготовьте от 1 до 2000, от 1 до 5 000, от 1 до 10 000, от 1 до 25 000, от 1 до 50 000 и от 1 до 100 000 бредов глюкозы FD для получения 2,5 микрограмм на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 мкг на миллилитр в двух миллилитрах непосредственно перед экспериментами в шкафу биобезопасности без освещения. Добавьте один микролитр инсулина к каждому из этих состояний.
После 40 минут инкубации декантируйте свободный от глюкозы DMEM из каждой лунки в 96 луночных пластинах и поглощайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами. Добавьте 100 микролитров каждый из различных условий обработки, описанных выше, в скважины вдоль одной колонны. И 100 микролитров от одного и того же условия обработки до колодцев вдоль ряда в обеих 96 стеновых плитах.
Маркируйте пластины, которые использовали условия, с инсулином и без него. Добавьте только DMEM без глюкозы в контрольные колодцы. Инкубируют пластину в течение 40 минут в инкубаторе клеточной культуры в темноте.
После этого клетки стимулировались в течение 40 минут. Перенесите стимулирующую среду с обеих пластин в новые 96 плит скважины, сохранив ту же экспериментальную компоновку. Промывайте ячейки PBS.
Удалите PBS и нанесите оставшийся раствор на стерильные бумажные полотенца. Добавьте ингибитор протеазы в буфер радиоиммунопреципитации для защиты белков. Поместите пластины, содержащие радиоинмунопреципитационный анализ, в шейкер на 30 минут.
Используя считыватель микропластин, измерьте флуоресценцию при возбуждении и длинах волн излучения на 485 и 535 нанометрах соответственно. Сначала в среде, содержащей внеклеточную глюкозу ФД, а затем в пластинке с радиоиммунопреципитационным анализом литизируют клетки в конце 30 мин инкубации. Выполните анализ белка BCA в соответствии с инструкциями производителя.
Количественно оценить концентрации белка в каждой лунке, содержащей радиоимунопреципитационный анализ литизированных клеток. Используют 10 микролитров радиоиммунопреципитации, анализируют гомогенат, а также измеряют концентрации белка и трижды для повышения точности измерений в 96 пластинах скважин. Количественная оценка белка на основе белковых стандартов, проанализированных вместе с образцами на каждой 96-луночной пластине.
Инкубируйте извлеченные ткани или органы в шестилуночной пластине, содержащей PBS, в течение одной минуты. Обработайте каждую ткань или орган в отдельном колодце. Через минуту поместите каждую салфетку на стерильное бумажное полотенце, чтобы впитать PBS.
Перенесите ткани или органы в отдельную шестистенную пластину, содержащую 4000 микролитров свободного от глюкозы DMEM, и инкубируйте в течение двух минут. Через две минуты удаляют и переносят ткани в колодцы шестилуночной пластины, содержащей 0,29 миллимоляра FD рабочего раствора глюкозы. Инкубируют шесть луночных пластин, содержащих ткани в рабочем растворе глюкозы FD при температуре 37 градусов Цельсия.
Соберите 100 микролитров рабочего раствора глюкозы FD из каждой скважины после 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут инкубации и переведите собранные 100 микролитров рабочего раствора глюкозы FD в 96 пластин лунок для анализа кинетики внеклеточного истощения глюкозы FD. Встряхните до и после сбора. Измерьте флуоресценцию при возбуждении в длинах волн излучения на 485 и 535 нанометрах соответственно с помощью считывателя микропластин.
Дозовая зависимость во внутриклеточном поглощении глюкозы ФД была значительно повышена в присутствии инсулина. Стимуляция инсулина привела к значительному снижению внеклеточного уровня глюкозы FD по сравнению с образцами без стимуляции инсулином. Внеклеточное истощение глюкозы FD может измерять изменение поглощения глюкозы с сопоставимой точностью с внутриклеточным поглощением глюкозы FD.
Внеклеточная глюкоза FD не истощалась в нестимулированном контрольном висцеральном жире в течение 120 минут инкубации. Напротив, предварительное лечение мышей инсулином или AAC2 перед рассечением приводило к значительному истощению внеклеточной глюкозы FD в течение временного интервала в 30 минут и 60 минут соответственно. Внеклеточная глюкоза FD не была истощена в инсулин-стимулированных эксплантах печени, по сравнению с нестимулированными эксплантами печени.
Внеклеточная глюкоза FD была значительно снижена зависящим от времени образом, а экспланты печени, предварительно обработанные AAC2,22%, истощение глюкозы наблюдалось во внеклеточной среде, содержащей необработанный мозг, после 60 минут инкубации. Среда, инкубированная с мозгом мышей, получавших инсулин, показала линейное снижение глюкозы FD на 5%. Стимулируемый AAC2 мозг привел к глубокому быстрому снижению до 67,4% внеклеточной глюкозы FD в течение первых 20 минут.
Вещества, связанные с промывкой, особенно важны для удаления следов глюкозы, крови или сыворотки в среде и/ органах, поскольку они могут мешать флуоресцентному чтению этих сред. После высокой пропускной способности идентификация соединений метаболитов в генах с гликемическими свойствами, а также оптимальных условий их действия in vivo эксперименты могут быть подтверждены с помощью меченой глюкозы FD и ПЭТ-сканирования для подтверждения накопления глюкозы в конкретных органах. Этот метод для обнаружения гликемического действия полезен как при удалении многочисленных метаболитов, терапевтических средств или их комбинаций, так и подчеркивает их действия в разных органах.
