Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток о роли взрослых стволовых клеток в регуляции поведения раковых клеток. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить оценку взаимодействий раковых клеток и стволовых клеток в пробирке без использования живых организмов. Этот метод имеет потенциал для метастазирования рака, поскольку он моделирует рекламирующую роль взрослых стволовых клеток в метастазах рака в твердые ткани, такие как кости.
Демонстрацию процедуры будет проводить Гусейн Апдик, аспирант моей лаборатории. Начните с использования стерильных миппов экстракции для удаления целлюлозно-бумажной ткани из центра зубов мудрости, полученных от молодых людей в возрасте от 17 до 20 лет. Поместите ткань в холодный полный DMEM в 10-сантиметровой ткани культуры блюда и использовать скальпель, чтобы фарш образцов в два-три миллиметра фрагментов.
Передача частей из каждого блюда в отдельных колодцев ткани культуры лечение шесть хорошо пластины и покрыть ткани в каждом колодце с 200 микролитров полного DMEM. Разрешить ткани, чтобы прикрепиться к днищам хорошо с по крайней мере два часа инкубации в увлажненной, 37 градусов по Цельсию и 5%CO2 клеточной культуры инкубатора. В конце инкубации, кормить ткани с 2 до 2,5 миллилитров свежей полной среде и культуры клеток в течение дополнительных восьми-девяти дней.
Когда культура достигла 80% слияния, мыть каждый хорошо с двумя миллилитров PBS следуют отслоение клеток с двумя миллилитров трипсина при 37 градусов по Цельсию. Через две минуты, остановить реакцию с двумя миллилитров полного DMEM на колодец и собирать клетки центрифугации. Затем повторно посовеская гранулы в 15 миллилитров свежей полной среды на две скважины клеток и прохождение клеток в колбы T75 для их последующей культуры.
После по крайней мере восьми проходов, визуализировать клетки с помощью световой микроскопии. Стволовые клетки зубной пульпы должны были прикрепляться к культурным блюдам и отображать морфологию клеток, похожую на шпиндель. Для анализа поверхностных маркеров, после того, как трипсинизация продемонстрирована, исправить клетки с 4%paraformaldehyde в течение 20 минут при комнатной температуре в 1,5-миллилитровых труб, а затем три моет в 500 микролитров PBS за стирку.
После последней стирки, этикетки клеток с соответствующими антителами интерес в 100 микролитров PBS на трубку в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации, мыть клетки три раза в PBS, как попродемонстрировано, и этикетки клеток с соответствующими вторичными антителами в 100 микролитров PBS на трубку в течение 30 минут при четырех градусах цельсия. Затем мыть образцы три раза в PBS и анализировать клетки по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами.
Для дифференциации стволовых клеток зубной пульпы, семя один раз от 10 до четырех клеток в отдельные колодцы 24-хорошо пластин в 500 микролитров полного DMEM для 24-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. На следующий день, заменить средний в каждом хорошо с соответствующей дифференциации среды и вернуть клетки в инкубатор, освежая среде два раза в неделю в течение двух недель. Дифференциация может быть подтверждена фон Косса и Alcian синий окрашивания в соответствии со стандартными протоколами.
После двух-четырех проходов, собирать условные средние супернатанты из культурных стволовых клеток зубной пульпы, когда культуры достигают 80% слияния. Затем центрифуга собранной среды для удаления любых отходов ткани материала и клеточного мусора и хранить средний при отрицательном 20 градусов по Цельсию до использования. Для лечения раковых клеток, семена один раз от 10 до пяти опухолевых клеток в отдельных скважин 12-хорошо пластины для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2.
На следующее утро используйте стерильный 200-микролитровый наконечник, чтобы сделать царапину травмы в каждой хорошо и сразу же заменить супернатант в каждой хорошо со свежей среде, содержащей различные концентрации условных среды. Затем немедленно наблюдайте за царапинами под перевернутым микроскопом и получать изображения травмированных культур через регулярные промежутки времени. В конце анализа измерьте закрытие царапин с течением времени в ImageJ.
Для оценки миграции стволовых клеток зубной пульпы, первое семя три раза от 10 до четырех стволовых клеток зубной пульпы на отдельные 24-хорошо пластины вставки с 0,4 микрон поры в 250 микролитров DMEM и инкубировать вставки на ночь при 37 градусов по Цельсию. Далее, семя пять раз 10 четырех опухолевых клеток в отдельных скважин 24-хорошо пластины в 500 микролитров DMEM для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро, поцарапать опухолевые клетки, как попродемонстрировано.
Замените супернатанты на 500 микролитров свежего DMEM и поместите одну зубную пульпу стволовых клеток, посеянных в каждую хорошо питаемую свежей средой. Затем немедленно наблюдать клетки на перевернутый микроскоп и изображение клеток через регулярные промежутки времени для оценки зубной мякоти стволовых клеток миграции. Для оценки прямого взаимодействия стволовых клеток зубной пульпы с раковыми клетками, попробуйте продать каждую помеченную культуру, чтобы получить одноклеточные суспензии и собрать диссоциированные клетки центрифугации.
Resuspend гранулы в различных клеточных связующим красителем решений, подготовленных в разбавитель C буфер, поставляется в соответствии с инструкциями производителя, и инкубировать клетки комнатной температуры в течение 10 минут. Прекратите окрашивание 100 микролитров сыворотки крупного рогатого скота плода и соберите клетки путем центрифугации. Затем центрифуга клетки с полной среды роста до покрытия пять раз 10 до четырех стоматологической пульпы стволовых клеток и опухолевых клеток на хорошо в шесть хорошо пластины на один к одному соотношению в двух миллилитров полной среды.
Соберите клетки после 24 или 48 часов инкубации центрифугации с последующим мытьем в PBS. Затем, повторное использование клеток в 300 микролитров флуоресценции активированных клеток сортировки буфера в пять миллилитров круглого дна потока цитометрических труб и вихря для разгона любых клеточных агрегатов перед анализом клеток в соответствии со стандартными протоколами цитометрического анализа потока. Стоматологическая пульпа стволовых клеток экспонат фибробластов, как морфология клеток после покрытия и выразить мезенхимальных стволовых клеток поверхностных антигенов, но не гематопоэтических маркеров клеток.
Изменения на морфологическом и молекулярном уровне, связанные с остео, хондро и адипогенной дифференциацией, также наблюдаются в культурах стволовых клеток зубной пульпы после соответствующей дифференциации коктейльного применения. Лечение царапин травмированных культур опухолевых клеток с 10 и 20% концентрации условных средних увеличивает закрытие нуля значительно по сравнению с контрольно-средне-обработанных культур опухолевых клеток. Секретные молекулы из зубной пульпы стволовых клеток вставить со-культуры также увеличение нуля закрытия в травмированных опухолевых клеток по сравнению с контрольных клеток совместно культур.
Флуоресценционный микроскоп, анализ взаимодействий ствола зубной пульпы и опухолевых клеток в культуре клеток in vitro показывает создание хорошо организованной структуры, в рамках которой опухолевые клетки быстро размножаются через 48 часов. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить два образца тканей в холодной среде и немедленно транспортировать образцы в лабораторию, чтобы свести к минимуму гибель клеток. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области стволовых клеток в изучении взрослых взаимодействий рака стволовых клеток у людей.
После этой процедуры, другие методы, такие как отслеживание иммунных клеток для дифференциальной помечены клетки различных стволовых клеток и типов рака могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительный вопрос о том, как взрослые стволовые клетки взаимодействуют с раковыми клетками и контроля метастазов рака. Не забывайте, что работа с образцами человека может быть опасной и что такие меры предосторожности, как анализ образцов пациентов на инфекционные заболевания и получение письменного согласия пациента, всегда должны быть реализованы при выполнении этой процедуры.
