Этот протокол имеет важное значение, поскольку наличие раковых стволовых клеток может быть связано с рецидивом или плохой результат после лучевой терапии. Изучение радиорезистентных стволовых клеток может дать подсказки для преодоления радиорезистентности. В этом методе раковые стволовые клетки солечат с цитометрией потока с помощью цитометрии потока, а способность к самообувечиваемости соленых клеток оценивается по анализу формирования сфер.
Анализ формирования колонии проводится для оценки радиочувствительности соленых клеток. Он определяет, сколько клеток потеряли способность генерировать синтез, которые образуют колонию после определенной дозы радиации. Эта рукопись предоставляет первые несколько шагов для изучения радиочувствительности раковых стволовых клеток, что создает основу для более полного изучения механизма.
Механизм исследования могут включать белки, связанные с повреждением ДНК ремонт, очистка реактивных видов кислорода, арест клеточного цикла и т.д. Это даст важные идеи о том, как раковые стволовые клетки получить radioresistance и как преодолеть сопротивление. Демонстрацией радиационной процедуры будет Чэнь-Нан Ли, специалист по радиации из нашего отдела.
Чтобы начать эту процедуру, культура A549 клеток в RPMI-1640 среды дополняется 10%FBS в 10 сантиметров блюд при 37 градусов по Цельсию, с 5%углекислого газа. Когда клетки достигают 80 до 90% слияния, удалить культуру среды. Кратко мыть клетки с тремя миллилитров PBS.
Затем добавьте три миллилитров 0,05%трипсина к каждому блюду. Удалите трипсин и оставьте мизин для переваривания клеток при 37 градусах По Цельсию в течение одной-трех минут. Часто проверяйте отслоение клеток, чтобы избежать чрезмерного пищеварения.
Когда клетки станут свободными и начнут отделяться от посуды, добавьте три миллилитров среды RPMI-1640, дополненную 10%FBS, и перенесите подвеску клеток в 50-миллилитровую трубку. Центрифуга при 300 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите клетки в 10 миллилитров PBS.
Перенесите 0,5 миллилитров клеточной подвески в новую трубку в качестве изотипного контроля. Центрифуга как контрольные, так и экспериментальные трубки при 300 раз g и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатантов.
Затем разбавьте как флуоресцентный диконъюгированный изотип управления и антитела в PBS к оптимальной концентрации titrated подготовить рабочий раствор. Переусейте элементы управления и экспериментальные клетки с каждым рабочим раствором и аккуратно перемешайте. Инкубировать образцы в темное время суток и при комнатной температуре в течение 30-40 минут.
Вымойте клетки, добавив 10 миллилитров PBS, смешивая осторожно, и центрифугирование при 300 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатантов и будем повторно помещенными клетками с помощью 10 миллилитров PBS. Далее поместите 40 микрометровых ситечкой клеток на новые 50 миллилитровых трубок, убедившись, что подготовить отдельную трубку и ситечко установки для управления и экспериментальных клеток.
Нанесите каждую ячейку подвески на соответствующий ситечко и собирать поток. Центрифугировать поток при 300 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно посовестите клетки с 0,2 до 1,0 миллилитров PBS и перенесите каждую подвеску клетки в отдельную пятими миллилитровую трубку для цитометрии потока.
В кабинете биологической безопасности, подготовить один шесть хорошо пластины для каждой дозы радиации, в том числе нулевой серой группы. Добавьте 1,5 миллилитров завершенных 1640 средств массовой информации к каждой хорошо. Разбавить собранные клетки с завершено 1640 средств массовой информации к плотности клеток 1000 клеток на миллилитр.
Затем добавьте разбавленную клеточную подвеску к колодцам и встряхните пластины горизонтально, чтобы равномерно распределить клетки в колодцах. Запись объема, добавленного в каждой группе дозы. Культура при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом.
После того, как клетки прикреплятся к нижней части скважин, добавьте завершено 1640 средств массовой информации к каждому колодец, пока высота средств массовой информации достигает одного сантиметра. Когда пластины передаются между комнатой клеточной культуры и комнатой лучевой терапии, оберните пластины алюминиевой фольгой или положите их в чистую коробку, чтобы избежать загрязнения. Держите пластины плоскими, чтобы избежать среднего разлива.
Далее установлено 20 сантиметров на 20 сантиметров радиационного поля. Поместите ткань эквивалент болюс 1,0 сантиметра толщиной на диване лечения и место шесть хорошо пластины на болюс, чтобы держать их в контакте. Убедитесь, что вся пластина находится в радиационном поле.
Установите расстояние между источником и кожей до 100 сантиметров и отрегулируйте высоту дивана для выравнивания среднего уровня поверхности до уровня лазера. Доставка назначенной дозы к каждой пластине в последовательности. После этого отведи тарелки в кабинет биобезопасности в комнате клеточной культуры.
Замените среду в каждой хорошо с двумя миллилитров завершена 1640 среды. Культура при 37 градусах Цельсия с 5%-миоградом, убедившись, что изменить средний каждые три-пять дней. Через семь-десять дней после облучения удалите среду и ненадолго вымойте клетки с помощью PBS.
В дым капот, добавить один миллилитр 4%формальдегида к каждому хорошо, чтобы исправить клетки в течение 10 минут. Затем снимите формальдегид и мыть каждый хорошо дважды, используя два миллилитров дистиллированной воды для каждой стирки. Добавьте один миллилитр 1%Crystal фиолетовый раствор пятна к каждому хорошо и пятно в течение 10 минут.
После этого удалите раствор кристально фиолетового пятна и трижды промыть клетки дистиллированной водой. Удалите воду и дайте пластинам высохнуть в течение 30 минут. Подсчитайте количество колоний с более чем 50 ячейками.
В этом исследовании, как альфа-2 дельты один высокий и альфа-две дельты один низкий A549 клетки сортируются. Некоторые маркеры могут показывать различные популяции и легко ворот. Тем не менее, некоторые маркеры просто показывают высокие и низкие модели выражения, а не отличительные положительные и отрицательные популяции.
В этой ситуации очень важен элемент управления изотипом. Выражение альфа-2 дельты в отсортированных клетках проверяется qPCR. Выражение CACNA2D1, гена, который кодирует альфа-две дельты один, выше в отсортированной альфа-2 дельты одной высокой клетки по сравнению с альфа-двумя дельтами одной низкой клетки.
Здесь показана типичная морфология сфер и эффективность формирования сферы. Альфа-2 дельта одно высокие клетки показывают более высокую эффективность образования сферы, предлагая более высокую емкость самообъемки. Здесь показаны типичные изображения колоний и кривых выживания.
Колония с около 50 клетками может быть исследована под микроскопом и помечена как эталон. Количество колоний подсчитывается, затем можно рассчитать фракцию выживания в каждой дозе и вычислить кривую выживания. Альфа-2 дельта одна высокая клетка относительно устойчива к радиации по сравнению с альфа-2 дельты одной низкой клетки.
Любые шаги, связанные с клеточной культурой, должны выполняться в кабинете биологической безопасности или ламинарный чистый скамейке. Чтобы избежать загрязнения, рекомендуется добавлять антибиотики в культурную среду после сортировки. Когда выдающийся маркер стволовых клеток рака предварительно идентифицирован по анализу формирования сферы, дальнейшая характеристика in vivo, ограничивающая анализ разбавления, может быть выполнена для оценки опухолевых способностей.
Из механизма изучения радиорезистервности, исследователи могут изучить белок, связанный с ремонтом повреждений ДНК, очистка реактивных видов кислорода, и арест клеточного цикла в ответ на излучение. Во время клеточного излучения, обратите внимание, что линейным ускорителем могут управлять только квалифицированные специалисты. Держитесь подальше от радиации.
Стоя, обратите внимание, что формальдегид летучий и опасный. Используйте формальдегид в паровой капюшон.
