Изоляция стволовых клеток остается серьезной проблемой из-за совместной изоляции клеток-предшественников с использованием современных методов. Мы разработали новый анализ без биомаркеров, чтобы изолировать тихие стволовые клетки от смешанных прародителей. Основным преимуществом этого сфероида основе, этикетки удержания анализа, он может расширить и изолировать живые стволовые клетки от своих дочерей прародителей FACS с помощью CFSE или Far Red маркировки.
В то время как обычные методы лечения искоренить большинство раковых клеток простаты, раковые стволовые клетки остаются из-за терапевтической устойчивости, тем самым вождения прогрессирования заболевания. Изоляция стволовых клеток позволит идентифицировать новые гены, которые могут быть терапевтически совместно направлены на эффективную ремиссию болезни. Наш анализ удержания этикетки применим для нормальной изоляции стволовых клеток от различных тканей и клеток, а также для исследования раковых стволовых клеток.
Важно отметить, что этот анализ применим к другим эпителиальным ракам клеток, таким как рак молочной железы и колоректального рака. Начните с покрытия 100-миллиметровых культур блюд с двумя миллилитров 2,5 микрограмма фибронектина раствора и инкубировать их на ночь при комнатной температуре. Затем аспирировать раствор и дайте культуре блюда высохнуть в шкафу биобезопасности в течение 45 минут.
Добавьте девять миллилитров эпителиальной среды роста клеток простаты в блюдо с фибронектином и держите его в тепле в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах Цельсия. Оттепель один флакон замороженных человеческих эпителиальных клеток простаты в 37 градусов по Цельсию водяной бане, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров теплой среды. Центрифуга клеточной суспензии при 500 раз г в течение пяти минут.
Затем аспирировать и отказаться от супернатанта. Перерасходовать клетки в один миллилитр теплой среды культуры и передать один миллилитр суспензии непосредственно на фибронектин покрытием блюдо с предварительно разогретой среде. Затем инкубировать блюдо в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию.
При совместной маркировке клеток подготовьтесь к ячейкам, помеченным BrdU, в 10-дней 2D-культуре, как описано в текстовой рукописи. Затем добавьте пять микромолейных CFSE или Far Red и инкубировать клетки в течение 30 минут. После инкубации, тщательно аспирировать среды с красителем и мыть клетки дважды с пятью миллилитров теплого PBS.
Далее выполните энзиматическое пищеварение с 05%трипсином ЭДТА в соответствии с рукописными указаниями. Центрифуга клетки на 500 раз g в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Клетки были повторно использованы в ледяной, один-к-одному подвале мембранной матрицы и культуры средней смеси для 3D-образования простасферы.
Чтобы подготовить культуру простасферы в 3D-матрице подвальной матричной системы, оттаивать матрицу мембраны подвала при четырех градусах Цельсия на ночь и держать ее на льду перед использованием. Затем аккуратно добавьте один миллилитр ледяной мембранной матрицы в равный объем среды ледяной культуры. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать, заботясь, чтобы не ввести пузырьки воздуха.
Resuspend пять раз от 10 до 1/4 человека простаты эпителиальных клеток в ледяной один-к-одному подвале мембраны матрицы и культуры сми смесь для общего объема 500 микролитров. Pipette решение нижней обода каждого хорошо и вихрем пластины равномерно распределить смесь. Поместите пластину в инкубатор двуокиси углерода 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеет.
Затем накройте его одним миллилитром теплой культуры среды на колодец, убедившись, что не беспокоить кольцо. Для сбора CFSE помечены prostaspheres заменить среды с двумя миллилитров dispase и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать несколько раз. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить матрицу, а затем собрать смесь сферы в 15-миллилитровую центрифугу трубки.
Центрифуга сфер на 500 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Перезагнул гранулы в 500 микролитров теплого 05%трипсина ЭДТА и перенесите их в 1,5-миллилитровую центрифугу. Инкубировать сферы при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, затем добавить 500 микролитров теплого PBS с 10%FBS.
Передайте их через одноми миллилитровый шприц с 26-калиберной иглой, чтобы полностью размежевать сферы. Центрифуга клетки на 500 раз g в течение пяти минут. Затем аспирировать и отказаться от супернатанта.
Переподходить клетки в один миллилитр теплой среды культуры с одним микрограммом на миллилитр пропидия йодида, чтобы испачкать мертвые клетки и инкубировать их в течение одной минуты при комнатной температуре. Повторите центрифугу и выбросьте супернатант. Затем промойте клетки одним миллилитром теплой среды.
Повторите центрифугу и выбросьте супернатант. Resuspend клетки в одном миллилитре теплой среды культуры и собирать клетки в пятими миллилитров полистирола круглые нижние трубки, фильтруя их через 35-микрон поры размер клетки ситечко оснастки шапки. Выполните FACS анализ трипсина-рассеянных клеток простасферы с маркировкой CFSE.
Использование не помеченных ячеек в качестве отрицательного контроля и клеток с маркировкой CFSE в качестве положительного контроля для настройки ворот, запуска образца для сортировки и сбора субпопуляций дробных клеток CFSE-high и CFSE-low. Первичные нормальные эпителиальные клетки предстательной железы человека были помещены в фибронектин покрытием культуры блюда и рост клеток был сохранен в 2D культуры. После перехода в 3D культуру с мембранной матрицей подвала, дифференцированные эпителиальные клетки медленно вымерли, и остались только стволовые клетки простаты.
Двойная маркировка эпителиальных клеток предстательной железы в 2D-культуре с последующим образованием сфероидов в 3D-культуре показала колокализацию BrdU, CFSE и Far Red в тех же клетках, сохраняющих этикетки. Двойной иммуностепенинг показал, что клетки, сохраняющие этикетки, обладают более низким уровнем цитокератина белка кератина 14, снижение клеточного соединения белка E-кадерина, увеличение стволовых клеток ранних маркерных белков Wnt10b и ALDH1A1, увеличение аутофагии белка LC3, и увеличение миозин IIB. Кроме того, анализ на основе сфероидов, удержания этикетки, успешно обнаруживает раковые стволовые клетки в образцах рака простаты.
CFSE помечены сохранения стволовых раковых клеток и сфероидов, полученных из образцов рака предстательной железы человека выставлены снижение E-кадерин белка по сравнению с не помечены клетки-предшественники. При попытке этого протокола, важно поддерживать матрицу в жидкой форме для культуры средней подготовки. Храните его на ночь при четырех градусах, и охладить пипетки советы в ледяной PBS до дозирования матрицы.
После изоляции стволовых клеток с использованием сфероидной основе этикетки удержания анализа, одноклеточной РНК секвенирования и протеомного анализа могут быть выполнены для выявления конкретных генов и новых биомаркеров в стволовых клетках. Изоляция живых раковых стволовых клеток с помощью анализа на основе меток на основе меток позволяет исследователям выращивать опухолевидные опухоли, полученные из раковых стволовых клеток, и проверять новые противоопухолявые препараты.
