Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области церебральной сосудистой физиологии, поскольку он относится к регуляции мозгового кровотока во время старения и развития хронических заболеваний. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет одновременно измерять внутриклеточный кальций и мембранный потенциал мозгового артериального эндотелия в его родной форме в физиологических условиях. Чтобы изолировать мозг мыши, под микроскопом удалить кожу и волосы над черепом.
И удалить чрезмерную кровь с холодным без кальция PSS. Далее сделайте разрез, используя только кончики стандартных ножниц для вскрытия. Начиная с затылочной кости и простираясь через носовую кость черепа.
Затем открыть ее череп тщательно вдоль разреза, используя грубо наконечником типсы и отделить соединительной ткани подвергать мозга. Аккуратно мыть изолированный мозг с холодным без кальция PSS в стакан, чтобы удалить кровь. Поместите вентралую сторону мозга в камеру, содержащую холодный раствор вскрытия для изоляции мозговых артерий.
Чтобы изолировать мозговые артерии, закрепить изолированный мозг в холодном растворе вскрытия, вставив через него две булавки из нержавеющей стали, в кремниевое полимерное покрытие, пропитанное углем, на дне стеклянной чашки Петри. Впоследствии хирургически изолируют задние мозговые артерии от 0,3 до 0,5 сантиметра сегментов от задней связи и базилярных артерий. Используйте булавки из нержавеющей стали для обеспечения обеих изолированных задних мозговых артерий в растворе вскрытия в чашке Петри.
Затем тщательно очистите изолированные задние мозговые артерии, удалив соединительной ткани с помощью заточенных тонко наклонных типсов. Разрежьте нетронутые артерии на один-два миллиметра для энзиматического пищеварения. В этой процедуре подготовьтесь к тритурации аппарата с помощью микроскопа, камеры и алюминиевой сцены с камерой и микроманипуляторами.
Закрепив микрохирург с помощью насосного контроллера, примыкающего к сцене и образцу. Далее полностью заполнешь титрование пипеткой с минеральным маслом и закрепим ее над микросхемой поршня. Затем с помощью микросиренго с контроллером насоса свяжись около 130 нанолитров раствора диссоциации в пипетку, обеспечивая при этом отсутствие пузырьков воздуха.
Впоследствии поместите нетронутые артериальные сегменты в один миллилитр раствора диссоциации с необходимой концентрацией ферментов в 10 миллилитров стеклянной трубке. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 10-12 минут для частичного пищеварения. После пищеварения замените ферментный раствор пятью миллилитров свежего раствора диссоциации.
Используя одноми миллилитровую пипетку, перенесите один сегмент в камеру, содержащую раствор диссоциации при комнатной температуре. Затем поместите пипетку в раствор диссоциации в камере и поместите ее близко к одному концу переваренного сосуда. Установите скорость в диапазоне от двух до пяти нанолитров в секунду на контроллер насоса для мягкой тритурации.
При просмотре через 100 раз до 200 раз увеличение снять и извлечь артериальный сегмент, чтобы разобщить гладкие мышечные клетки при производстве эндотелиальной трубки. При необходимости осторожно используйте мелконаводные типсы, чтобы отделить диссоциированную адвентитию и внутреннюю эластичную ламину от эндотелиальной трубки. Подтвердите, что все гладкие мышечные клетки разобщены и что только эндотелиальные клетки остаются нетронутыми трубки.
Используя микроманипуляторы, закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянной крышке скольжения суперфузионой камеры с помощью борозиликатного стекла, закрепления пипеток. Вымойте диссоциированных adventitia и гладкие мышечные клетки из камеры. И заменить раствор диссоциации на два моляра больше хлорида кальция PSS.
Перенесите мобильную платформу с закрепленной эндотелиальной трубкой на микроскоп суперфузии и экспериментальной установки. Затем используйте шесть чистых 50 миллилитров резервуаров для непрерывной доставки PSS и соответствующих лекарственных растворов в ходе эксперимента. Используйте в линии клапан управления потоком вручную установить скорость потока, как последовательный, как поток ламинера при сопоставлении потока корма для вакуумного всасывания.
Доставка PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки, по крайней мере пять минут до записи фоновых данных и загрузки красителя. Чтобы измерить мембранный потенциал одновременно с внутриклеточной концентрацией кальция, потяните острый электрод и заполньте его двумя хлоридом молярного калия для записи из клеток, загруженных красителем фура-2. Для изучения внутриклеточной связи с помощью передачи красителя, backfill микроэлектрода с 0,1%propidium йодид растворяется в двух молир хлорида калия.
Далее поместите электрод над серебряной проволокой, покрытой хлоридом, в держатель пипетки, прикрепленный к электрометровой головной ступени, закрепленной микроманипулятором. Используйте микроманипулятор, чтобы кратко располагать кончик электрода в протекающей PSS в камере, при просмотре через четыре раза цели. Впоследствии установите потенциал мембраны отдыха до нуля в соответствии с заземленным потенциалом ванны.
При желании используйте звуковые базовые мониторы, связанные с электрометрами, чтобы связать звуковой шаг с потенциальными записями. После этого увеличьте увеличение до 400 раз, используя цель в 40 раз, и располагайте кончик электрода чуть выше клетки эндотелиальной трубки. Отрегулируйте фотометрическое окно с помощью программного обеспечения для фотометрии, чтобы сосредоточиться на 50-80 эндотелиальных ячейках.
Затем аккуратно поместите электрод в одну из клеток эндотелиальной трубки с помощью микроманипулятора и подождите не менее двух минут, пока потенциал мембраны отдыха стабилизируется. После того, как потенциал мембраны отдыха стабилен при ожидаемом значении, включите фотомультипьерную трубку на флуоресцентном интерфейсе при отсутствии света и начните приобретение внутриклеточной концентрации кальция захватывающим Fura-2 поочередно на 340 и 380 нанометров при сборе выбросов флуоресценции на 510 нанометров. После одновременного измерения мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция, позволяют около пяти минут для суперфузии эндотелиальной трубки с PSS при постоянной скорости ламинарного потока до применения препаратов.
Нанесите препарат, приготовленный в PSS, в камеру суперфузии с постоянной скоростью потока. Во время лечения препарата измеряется мембранный потенциал в соотношении F340/F380 одновременно. После того, как эксперимент будет сделан, вывести электрод из клетки.
Затем прекратите соответствующие записи мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция и сохраните файлы для анализа данных. Это дифференциальное интерференционное контрастное изображение мыши мозговой артериальной эндотелиальной трубки, скорректированное для эксперимента в фотометрическом окне с использованием 40-разовой цели. Острый электрод помещается в ячейку, как показано в верхней части изображения.
Вот примеры необработанных следов для одновременного измерения соотношения F340/F380 и мембранного потенциала в ответ на 100 микромолянных АТФ. После этой процедуры, другие методы, такие как конфокальная флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся микродомена сигнализации эндотелиального кальция, и реактивных видов кислорода, в качестве примеров. В целом этот метод будет продолжать прокладывать путь для исследований в клеточной физиологии для изучения сосудистой функции и старения в крови и лимфатической циркуляции.
