Этот метод обеспечит лучшее понимание функции паренхиматозного артериолярного эндотелия, который напрямую связывает внутримозговой кровоток с подпиткой нейронной и глиальной активности по всему мозгу. Явным техническим преимуществом перед артериольным эндотелием является улучшенное разрешение морфологических размеров и кальция и электрической сигнализации между отдельными внутримозговыми эндотелиальными клетками и их соответствующими органеллами. Изначально выделение и обследование внутримозгового эндотелия будет очень сложным.
Тем не менее, можно освоить эту технику с большим количеством практики, сопровождаемой терпением и самоотверженностью. Промыть изолированный мозг холодным раствором для рассечения в стакане или чашке Петри, чтобы удалить оставшуюся кровь с поверхности мозга. Поместите вентральную сторону мозга лицом вверх в камеру, содержащую холодный раствор для рассечения, чтобы изолировать паренхиматозные артериолы.
Чтобы изолировать паренхиматозные артериолы, закрепите изолированный мозг стальными штифтами в холодном растворе для рассечения в чашке Петри, содержащей кремниевое полимерное покрытие глубиной более 50 сантиметров, наполненное древесным углем. Вырежьте прямоугольник мозговой ткани из обоих полушарий острыми и выровненными ножницами для рассечения вокруг MCA, убедившись, что верхняя часть сегмента ткани находится за пределами точки ветвления от круга Уиллиса. Закрепите мозговую ткань в чашке с помощью MCA, обращенной вверх стальными штифтами.
Осторожно сделайте неглубокий разрез возле штифтов и удалите пиа небольшими щипцами, аккуратно отслаиваясь от одного конца к другому. Тщательно закрепите выделенную пиа паренхиматозными артериолами, разветвленными от MCA, в блюде булавками и тщательно рассекните паренхиматозные артериолы. Отрежьте все оставшиеся дистальные ветви и убедитесь, что артериола чистая без прикрепления ткани.
Используйте эту чистую интактную артериолу для ферментативного пищеварения. В качестве альтернативы, разрежьте каждую артериолу на две части для ферментативного пищеварения, чтобы при желании подготовить эндотелиальные трубки. Для частичного переваривания артериолярных сегментов поместите неповрежденные артериолярные сегменты в один миллилитр диссоциационного раствора в стеклянной трубке объемом 10 миллилитров, содержащей папаин, дитиоэритрит, коллагеназу и эластазу.
Инкубируйте артериолярные сегменты при 34 градусах Цельсия в течение 10-12 минут. Чтобы изолировать артериолярную эндотелиальную трубку, поместите тритурационную пипетку, прикрепленную к инъектору микрошрица, в диссоциационный раствор в камере и расположите его близко к одному концу сегмента переваренного сосуда. Установите скорость в диапазоне от одного до трех нанолитров в секунду на контроллере насоса для мягкой тритурации.
Поддерживая увеличение от 100X до 200X, выведите артериолярный сегмент в пипетку, а затем введите для диссоциации адвентиции и гладкомышечных клеток. Тритурируйте сегмент сосуда до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы, и только эндотелиальные клетки останутся в виде неповрежденной трубки. С помощью микроманипуляторов закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянном крышке в камере с помощью боросиликатного стекла, закрепляющего пипетки Для измерения эндотелиального мембранного потенциала, при просмотре через объектив 4X, осторожно расположите острый наконечник электрода прямо над ячейкой артериолярной эндотелиальной трубки в протекающий физиологический раствор соли с помощью микроманипулятора.
Постепенно увеличивайте увеличение до 400X и перепозиционируйте наконечник электрода по мере необходимости. С помощью микроманипулятора аккуратно вставьте наконечник острого электрода в одну из ячеек эндотелиальной трубки и начните запись ВМ с помощью электрометра. Как только эндотелиальная ВМ в состоянии покоя стабилизируется от минус 30 до минус 40 милливольт, применяют желаемые фармакологические средства на экспериментальную цель.
Загрузите эндотелиальную трубку флуоресцентным трекером для плазматической мембраны или желаемой органеллы при 37 градусах Цельсия в течение 15-30 минут. Промыть клетки свежим суперфузионным физиологическим солевым раствором и визуализировать живые клетки под микроскопом на длине волны возбуждения соответствующих красителей. Эндотелиальную функцию оценивали путем измерения внутриклеточного кальция и мембранного потенциала в ответ на фармакологический агент MTA, мощный агонист пуринергических рецепторов при 37 градусах Цельсия.
При применении одного микромолярного МТА внутриклеточная концентрация кальция быстро увеличивается с сопутствующей гиперполяризацией. Кроме того, интактный эндотелий инкубировали при 37 градусах Цельсия с флуоресцентными трекерами для визуализации для изучения клеточной морфологии. Визуализация живых эндотелиальных клеток показала совместное окрашивание плазматической мембраны и ядер.
Плазматическую мембрану окрашивали вместе с флуоресцентным пятном эндоплазматического ретикулума, в результате чего области видимого перекрытия ER в непосредственной близости от плазматической мембраны кажутся оранжевыми. Экспериментатор должен быть осторожен во время рассечения и изоляции, чтобы избежать повреждения артериол, потому что поврежденная артериола определенно не даст неповрежденной эндотелиальной трубки. После процедуры клетки могут быть использованы для фиксированной иммуногистохимии с флуоресцентными антителами или окрашивания живых клеток органелл и мембранных липидов.
Эта методика позволит генерировать новую информацию для понимания механизмов, лежащих в основе мозгового кровотока на фундаментальном для физиологии уровне и выбирать переходы к патологии для терапии.
