Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия вирус-хозяин о том, как эффективно установить вирусную инфекцию в Drosophila меланогастер. Этот метод наноинъекции позволяет точно контролировать дозу инфекции вируса и может быть легко применен к инфекциям с другими микробными патогенами. Начните с роста в один раз от 10 до седьмой жизнеспособной S2 звездных клеток на миллилитр, как свободные, полуприемник монослой в 10 сантиметров клеточной культуры блюдо с 10 миллилитров полного Шнайдера Drosophila Medium без дополнительного углекислого газа при 25 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Во время инкубации, resuspend свежеоттая Дрозофила C Вирус или DCV к множественности инфекции 0,01 в один миллилитр полной среды и добавить вирусный раствор в блюда клеточной культуры. Затем верните пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех-пяти дней. Вирус готов к сбору, когда морфология клеток выглядит размытой, а среда культуры полна черных частиц, указывающих на клеточный мусор.
Смешайте супернатант путем пипетки несколько раз, прежде чем передать всю культуру клеток в 15 миллилитровую трубку для лиза клеток-хозяина при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для генерации рабочих концентраций вируса, оттепель клеточной подвески в 25 градусов по Цельсию водяной бане с постоянной тряской перед pelleting клеточного мусора центрифугации. Затем перенесите супернатант в новую стерильную 15-миллилитровую трубку для вихревого и алицитирования до 200 микролитров вирусного раствора на трубку.
Чтобы определить среднюю культуру вирусной ткани инфекционной дозы, первое семя один раз от 10 до пяти звездных клеток S2 в 100 микролитров полной среды в восемь скважин на столбец в 12 рядах 96 пластины скважины. Затем верните пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию. Случайным образом выберите пять трубок вируса из хранилища минус 80 градусов по Цельсию.
Пока клетки оседают, заполните 10 стерильных 1,5 миллилитров микроцентрифугных трубок с 450 микролитров стерильной полной среды и добавьте 50 микролитров вирусного бульона к первой 1,5 миллилитровой трубке, содержащей 450 микролитров стерильной полной среды, разбавляющих подвески 10 раз за шаг до 12-й хорошо. В конце инкубации добавьте 50 микролитров каждого разбавления в соответствующий колодец в каждой колонке для этой трубки вируса и добавьте 50 микролитров среды культуры без вируса к одному колодец на столбец в качестве отрицательного контроля хорошо. Затем поместите пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех дней и оцените цитопатический эффект каждого вирусного бульона под микроскопом Brightfield при ежедневном увеличении на 20X.
Классифицируемый колодец, в котором клетки выглядят размытыми, а среда полна фрагментов, как положительный колодец и колодец, в котором морфология клеток нормальная как отрицательная хорошо. Перед размножением тщательно смешайте 400 микролитров по 50 микрограмм на миллилитр тетрациклина с четырьмя граммами свежей стандартной кукурузной муки мухи пищи и поместите пищу при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы испаряться этанола. На следующее утро, тепло пищи до комнатной температуры и место пищи и 20 женщин и 10 мужчин недавно eclosed взрослых мух в племенной флакон для трех-четырехдневного инкубации размножения при 25 градусов по Цельсию и 60% влажности при нормальном светло-темном цикле.
Когда достаточное количество яиц были заложены, собирать недавно eclosed взрослых мух под легким потоком углекислого газа и породы Drosophila снова еще два раза, как только что продемонстрировали. После трех поколений тетрациклинной обработки, собрать пять мух под легким потоком углекислого газа и гомогенизировать мух с 250 микролитров двойной дистиллированной воды и несколько 0,5 миллиметр стерильных керамических бусин. Через минуту добавьте 250 микролитров 2X Buffer A в образец для вихревого замораживания образцов при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Далее, быстро оттепели образцов от минус 80 градусов по Цельсию хранения в 25 градусов по Цельсию водяной бане, а затем 30-минутной инкубации в 70 градусов по Цельсию водяной бане до извлечения геномной ДНК и усиления ДНК полимеразы цепной реакции в соответствии со стандартными протоколами. Подтвердите отсутствие Wolbachia 16 малых РНК и wsp в каждой мухе гомогената гель электрофорез в соответствии со стандартными протоколами. Затем задняя Wolbachia-бесплатный запас летать на стандартной кукурузной муки летать пищи, как попродемонстрировано.
Для вирусной инфекции, сначала используйте стереомикроскоп и тонкие типсы, чтобы сломать кончик стеклянной капиллярной иглы до соответствующего диаметра для наноинъекции. Чтобы собрать инжектор, поместите потолок O-кольцо и белый проем на металлический поршень инжектора с большой ямочка лицом наружу. Используйте шприц, оснащенный иглой 30 калибра, чтобы заполнить стеклянную иглу минеральным маслом и поместить иглу через воротник.
Поместите больше O-кольцо вокруг основания воротника около одного миллиметра от тупой конец иглы и смонтировать иглу на поршень инжектора. Закрепите иглу на поршене и нажмите пустую кнопку, чтобы расширить поршень микроинжектора до тех пор, пока не будет слышен звуковой сигнал. Теперь нажмите заполнить втягивать поршень пять миллиметров и окунуть иглу в 100 доска формирования единицы вирусной подвески.
Аккуратно встряхните один или, по крайней мере, три флакона из 20 Wolbachia свободных мужчин Drosophila на инъекцию блюдо. Мужские наделенные мухи предпочтительнее во время спаривания и воспроизводства может влиять на самок. Затем ввимите грудную клетку каждой мухи с 50,6 нанолитров вирусного раствора в слегка светлую цветную область между мезоплюрой и птероплеурой и измерьте нагрузку DCV с помощью анализа цитопатических эффектов и количественного РТР от наземных мух, как только что продемонстрировано.
После инъекции осторожно перенесите мух на свежий флакон и поместите флакон в горизонтальное положение, чтобы мухи не прилипли к среде, восстанавливаясь после анестезии. Инъекции отнимая много времени, но репликация DCV очень быстрая, поэтому очень важно записать точное время на трубке, как только все мухи из каждого флакона были введены. Вирусная инфекция может вызвать клеточный лиз и цитопатические эффекты наблюдаются в течение трех дней после заражения.
Wolbachia 16s rRNA и wsp праймеры могут быть использованы для обнаружения присутствия Wolbachia и Drosophila, как попродемонстрировано. Wolbachia свободных мух экспонат значительно снизилась выживаемость после инфекции DCV и в дозе зависимых образом. DCV активирует противовирусные сигнальные пути у хозяина, которые имеют решающее значение для противовирусной инфекции в Дрозофиле, о чем свидетельствует снижение выживаемости и повышенная вирусная нагрузка у мух-мутантов Dicer-2.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что загрязнение генотипом Wolbachia может повлиять на восприимчивость Drosophila меланогастер летит к инфекции DCV. После этой процедуры, другие методы, такие как более масштабный генетический экран могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о под определенными генами хозяина, необходимых для вирусной инфекции или противовирусных ответов. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области вирусных заболеваний человека, чтобы изучить механизмы, лежащие в основе вспышек эндемических вирусных инфекций человека в модели Drosophila melanogaster.
Не забывайте, что работа с вирусом может быть чрезвычайно опасной и что такие меры предосторожности, как ношение соответствующего защитного оборудования, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
