Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Candida о вирулентности штамма и вкладе конкретных генов в эти процессы. Основными преимуществами этой техники является то, что она позволяет избежать проблем, связанных с использованием животных, является надежным, быстрым, дешевым, и обеспечивает большое количество животных за эксперимент. Вообще говоря, люди, которые являются новыми для этого метода, скорее всего, борьба немного, потому что они будут иметь некоторые трудности оценки жизнеспособности червя до начала эксперимента или они могут иметь некоторые проблемы с непоследовательной инъекции червей.
Закажите личинки у оптовиков и поставщиков, которые не вводят гормоны, антибиотики или другие методы лечения личинок и которые способны поставлять и доставлять живые образцы. Когда личинки прибывают, проверьте каждый контейнер, чтобы подтвердить здоровье и жизнеспособность личинок. Здоровые личинки будут полностью погружены под постельные принадлежности, движущихся и обладающих желтой, светлой окраской загара с несколькими личинками, содержащими черные отметины или обесцвечивания вдоль тела.
Личинки могут храниться в контейнерах в проветриваемом пространстве при температуре окружающей среды до двух недель. Чтобы подготовить дрожжевые клетки для инфекции Galleria mellonella, вырастить штаммы C.albicans, которые будут введены на ночь в три миллилитров свежего дрожжевого бульона-пептон-декстрозы на штамм в стандартных трубках культуры на вращающемся барабане на средней скорости и 30 градусов по Цельсию. На следующее утро, собирать клетки центрифугации, и мыть дрожжи три раза в пять миллилитров свежих PBS процентов центрифугации.
После последнего мытья, повторное распределение клеток в один миллилитр свежих PBS и передачи дрожжей в микроцентрифуг трубки. Серийно разбавляют клетки в дополнительных концентрациях PBS от одного до 100, от одного до 1000 и от одного до 100 000 концентраций, и подсчитывают клетки от одного до 100 и от одного до 1000 разбавления. Отрегулируйте клетки в 2,5 раза от 10 до седьмого клетки на миллилитр концентрации PBS в новой микроцентрифугной трубке, и подтвердите точность инфекционной дозы, поместив соответствующий объем от одного до 100 000 разбавления для достижения 100 единиц формирования колонии на одной дрожжевой пептон-декстрозы агар пластины для каждой культуры, которые будут использоваться в инфекции.
Чтобы заразить личинки клетками Candida, сначала распределив небольшое количество постельных принадлежностей воскового червя в один пустой, 100 на 15 сантиметров стерильную чашку Петри на биологическую репликацию, и стерилизовать 10-микролитровый шприц, оснащенный 26-калиберной иглой три раза с 10 микролитров 70%этанола и три раза с 10 микролитров PBS на стирку. Далее вихрь прививки разбавления C.albicans, и загрузить 10 микролитров клеток в шприц. Откройте один контейнер из личинок G.mellonella, и использовать палец, чтобы тщательно перевернуть постельные принадлежности, чтобы раскрыть личинки, выбирая желтый, загар личинки аналогичного размера, которые находятся в добром состоянии здоровья с отсутствием черной пигментации на телах, используя средние и указательные пальцы и большой палец, чтобы забрать одну личинку таким же образом, как схвивая карандаш.
Roll личинки на спину, чтобы ноги лицом вверх, держа всю длину тела между пальцами и большим пальцем, так что личинка не в состоянии завить или оторваться от инъекции. С другой стороны, поверните шприц так, чтобы игольчатая скошенная обращена вверх, и медленно вставьте всю длину скошенной в тело на стыке с задней левой ногой, гарантируя, что игла проникает в тело и не просто толкает тело личинки внутрь. Наиболее важным шагом в этой процедуре является инъекция воскового червя таким образом, что повреждение личинки тела сводится к минимуму и полный болюс прививался.
Затем ввилите все 10 микролитров инокулума Candida и извлекайте иглу. Со-дом до 10 личинок вводят из той же культуры Candida в каждом 100-на-15-миллиметровой чашки Петри после прививки, и инкубировать личинку при 37 градусов по Цельсию в течение восьми дней. Проверяйте посуду каждые 24 часа, чтобы следить за смертью.
Смертность может быть первоначально оценена по затемненной пигментации, образованию черных пятен или тел, а также отсутствию движения. Чтобы подтвердить смертность, используйте пинцет, чтобы аккуратно свернуть умирающих личинок на спину и слегка тыкать личинки нижней с пинцетом. Личинки, которые начинают окукливаются в моли могут быть включены в анализ, но должны быть удалены, если они начинают линьки.
Нет существенной разницы в кинетики смерти G.mellonella существует между личинками инфицированных нулю или 10 дней после прибытия. Характерные признаки болезни возникают у личинок обоих возрастов, которые поддаются инфекции, начиная с обесцвечивания, что уступает место черным пятнам до полной потери подвижности и в конечном итоге смерть. Инфекция C.albicans ускоряет этот процесс обесцвечивания и заболеваемости, но не изменяет каскад фенотипических маркеров, ведущих к смерти по сравнению с неинфицированными или инъекционными личинками PBS.
Примечательно, что инфекция G.mellonella брачными гомо-или гетерозиготами от любого из протестированных клинически изолированных штаммов C.albicans производит высокие показатели смертности по сравнению с животными, введенными PBS, в то время как инъекции прототрофических производных штаммов окутывает смертельный эффект в этой модели. Важно помнить, чтобы выбрать здоровые личинки и быть нежным в обращении с личинками. Если несколько штаммов будут привиты, позаботьтесь, чтобы не позволить клеткам Candida сидеть в PBS слишком долго.
После этой процедуры, другие методы, такие как иммунологическое профилирование и локализация Candida в личинках могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о взаимодействии между хозяином и грибковых патогенов во время инфекции. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей, чтобы исследовать candida патогенеза с использованием высокой пропускной способности форматов. Не забывайте, что работа с Candida albicans требует ухода и что стандартные меры предосторожности, включая износ оборудования личной защиты, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
