Этот протокол описывает использование Galleria mellonella в качестве альтернативной модели инфекции для изучения туберкулеза, уменьшая количество моделей млекопитающих, используемых в исследованиях. По сравнению с обычными моделями млекопитающих, такими как мыши, Galleria mellonella является более дешевой, этически приемлемой и более доступной моделью для изучения туберкулеза. Дальнейшая оптимизация этой модели позволит скрининг эффективности и токсичности препарата-кандидата и будет способствовать разработке срочно необходимых новых терапевтических средств от туберкулеза.
Galleria mellonella обладает сложной врожденной иммунной системой, сравнимой с системой млекопитающих. Изучение взаимодействия хозяина и патогена может еще больше выявить роль врожденного иммунитета при туберкулезе. Использование Galleria mellonella в качестве инфекционной модели не ограничивается туберкулезом и широко используется для других бактериальных и грибковых патогенов в течение последнего десятилетия.
Для начала разморозите замороженный 1,2-миллилитровый глицерол запас Mycobacterium bovis BCG lux, штамм вакцины в Монреале, преобразованный с шаттл плазмидным pSMT1, несущим гены luxAB. В помеченной 250-миллилитровой колбе Erlenmeyer прививают 15 миллилитров бульона Middlebrook 7H9 с разморощенной 1,2-миллилитровой алицита BCG lux. Поместите колбу в герметичный контейнер для биобезопасности и инкубировать при 37 градусах цельсия в орбитальном инкубаторе шейкера при 220 об/мин в течение 72 часов.
После инкубации приготовьте 1:10 разбавления культуры в фосфатно-буферном солевом растворе в люминометровых трубках, вихре и загрузите люминометрические трубки в люминометр. Загрузите субстрат 1%n-дециляльдегид в абсолютный этанол в платформу инжектора и измерить биолюминесценцию. Преобразование биолюминесценции в колониообразующие единицы для проверки роста культуры люкс BCG.
Передача культуры в центрифугу трубки и центрифуги на 2, 175 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Откажитесь от супернатанта в соответствующее дезинфицирующее средство с известной микобактериоцидной активностью. Вымойте клеточные гранулы дважды в 50 миллилитров PBS-T путем центрифугирования в 2, 175 раз г в течение 10 минут, чтобы предотвратить бактериальное слипание.
После окончательной стирки, декант отходов supernatant и повторно mycobacterial ячейки гранулы в требуемом объеме PBS-T разбавить микобактериальной подвески до желаемой плотности клеток. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление инокулума в 24-х пластинах с помощью PBS-T. Плита из 10 микролитров каждого разбавления на Middlebrook 7H11 агар пластин в дублировать перечислить инокулума CFU рассчитывает.
Поддерживайте приобретенные личинки instar в темноте при 18 градусах по Цельсию по прибытии и используйте в течение одной недели после покупки. Определите и выберите здоровых личинок для экспериментов на основе равномерного цвета крема, соответствующего размера и веса, высокой подвижности, и обладающих способностью исправить себя при включении. Используя пинцет тупого конца, тщательно подсчитайте здоровых личинок в чашку Петри выстроились с слоем фильтровальной бумаги и хранить при комнатной температуре в темноте до использования.
Подготовьте платформу впрыска, приклеив круглую фильтровальную бумагу диаметром 94 миллиметра к плоской, поднятой поверхности. Аспирировать три тома 70% этанола в 25-микролитер микросирол для стерилизации, отбрасывания и дальнейшего полоскания с тремя томами стерильных PBS-T. Затем, resuspend подготовленный BCG люкс inoculum и аспирировать 10 микролитров в стерилизованной микросырья.
Используйте отдельный шприц для аспирации PBS-T для отрицательного контроля. После 10 инъекций, повторно использовать BCG люкс inoculum для обеспечения равномерной подвески клеток. Используйте пинцет, чтобы забрать одну личинку и поместить на платформу инъекций.
На платформе переверните личинку на спину и обездвиживайте, закрепив голову и хвост пинцетом. Найдите последний левый пролег, отсчитывание от головы личинки и тщательно вставьте кончик иглы глубиной от пяти до шести миллиметров под углом от 10 до 20 градусов к горизонтальной плоскости. Ввимить инокулум из шприца.
После каждой инфекции перенесите зараженную личинку в чашку Петри, облицованную слоем фильтровальной бумаги. Одна 94-миллиметровая чашка Петри может вместить до 30 личинок. Храните чашку Петри в вентилируемой темной коробке внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом.
Следите за выживаемость личинок каждые 24 часа. Личинки считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на прикосновения. Завехать выживаемость и оценить статистическую значимость с помощью теста Мантел-Кокс.
Каждые 24 часа, случайным образом выбрать пять инфицированных личинок и использовать ватный тампон, пропитанный 70% этанола мягко стерилизовать личиночинок поверхностей. Поместите личинки по отдельности в двухми миллилитровые лизайные матричные трубки, содержащие 800 микролитров стерильных PBS. Затем используйте гомогенизатор для гомогенизации личинок в течение 60 секунд при шести метрах в секунду.
Центрифуга лисинг трубки на 3, 500 раз g в течение пяти секунд, чтобы удалить гомогенат из крышки и тщательно декант гомогената в пять стерильных люминометр трубки индивидуально. Зарезервировать 100 микролитров гомогената в стерильной 1,5-миллилитровой реакционной трубке. Восстановите оставшийся гомогенат путем мытья лизных матричных трубок одним миллилитром PBS-T и пипеткой в соответствующие люминометрические трубки.
Вихрь люминометра труб и измерения биолюминесценции гомогенатов на люминометре. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление зарезервированных 100 микролитров гомогената в 24-колодец культурных пластин с помощью PBS-T. Pipette 10 микролитров разбавления на каждой агарной пластине Middlebrook 7H11 и использовать стерильный пластины распределитель для распространения.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух недель. После этого подсчитывайте колониообразующие единицы. Определите RLU к CFU отношение BCG lux следуя за инфекцией in vivo.
В этом эксперименте, BCG люкс доза зависит вирулентность наблюдалась в личинках G.mellonella в течение 96-часового инкубационный период. Смертельная доза, необходимая для 50%ларвал смертности было установлено, что один раз 10 к власти семь CFU. Контрольные группы, вводимые с 10-микролитерной дозой PBS-T или те, которые просто кололи, имитируя травмы иглы, не повлияли на здоровье личинок и не привели к увеличению смертности.
Для личинок, инфицированных два раза 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс, меланизация личинок спинной линии наблюдалось от 48 часов после инфекции и системной меланизации наблюдалось от 96 часов после инфекции. Инфекция с одним раз 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс привело к первоначальному снижению биолюминесценции в течение первых 72 часов после инфекции. Однако, после 72 часов после заражения, биолюминесценция BCG люкс начал плато, что свидетельствует о создании стойких инфекции.
В этой конкретной инфекционной системе коэффициент in vivo RLU и CFU колебался от 2:1 до 5:1 при среднем 4:1 в течение 168-часового курса. Во время инъекции не забудьте обезопасить личинки так, чтобы свести к минимуму риск чрезмерного протенетирования. Случайный прокол кишечника может привести к увеличению смертности.
Проводя гистопатологический анализ, можно визуализировать введение микобактерий с клетками-хозяинами. Дальнейший транскриптомный анализ может выявить взаимодействие на геномном уровне. Использование этой инфекционной модели может позволить быстрое тестирование новых кандидатов наркотиков на ранней стадии разработки, значительно сократив количество животных, используемых в скрининге наркотиков.
Эта модель инфекции требует использования шприца, который может быть связан с травмой иглы палкой. Мы рекомендуем использовать нашу технику инъекций, чтобы свести к минимуму такой риск.
