A mobilidade celular cancerígena é crucial para o início da metástase. Portanto, a investigação do movimento celular e da capacidade invasiva das células tumorais é de grande interesse. Este método integrado para investigar a migração e invasão de células cancerígenas, em uma única plataforma em tempo real, fornece uma opção facilmente reproduzível e eficiente para estudar mobilidade celular e patologia.
Este método pode fornecer informações sobre a invasão de células cancerosas, através da matriz extracelular, e pode ser aplicado a outros tipos de células. Para alcançar um tempo ideal de risco, certifique-se de que a densidade de semeadura tenha sido otimizada e não prolongue o período de incubação uma vez que a monocamada celular tenha atingido 100% de confluência. Para determinar o número ideal de células semeadas para um ensaio de migração, coloque as células em uma variedade de densidades em triplicado em uma placa de 96 paredes.
Coloque a placa no imager de célula ao vivo e selecione as varreduras de agendamento da lista de tarefas no software imager. No painel de configuração da gaveta, determine as posições da placa e clique em adicionar vaso para selecionar o tipo de placa. No painel de configuração da digitalização, selecione ou edite o padrão de varredura de acordo com a configuração da placa experimental e defina o tipo de varredura como padrão.
Clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione intervalos definidos. Em seguida, defina adicionar varreduras a cada duas horas durante 24 horas e clique em aplicar. Após 24 horas, abra a configuração da gaveta para permitir que a placa experimental seja selecionada e clique em remover o vaso.
Selecione de três a seis imagens representativas e coloque-as em uma nova coleção de imagens. Para determinar uma definição adequada de processamento, use ajuste de segmentação, limpeza e filtros para aplicar uma máscara de confluência apropriada e use a corrente de visualização all'to ver a precisão das máscaras. Inicie o trabalho de análise e determine uma densidade celular otimizada, de acordo com uma confluência aproximada de 100% contra o tempo, dentro de seis a dezoito horas, dependendo de quando o ensaio migratório começa.
Em seguida, aplique a ferramenta de análise de processamento de confluência às imagens de contraste de fase de alta definição coletadas automaticamente para gerar uma curva de proliferação celular contra o tempo. Antes de iniciar o ensaio, cubra a placa para o ensaio de invasão com 50 microliters de gel de matriz extracelular, diluído em meio de cultura celular gelada, a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular durante a noite.
Na tarde seguinte, aspire suavemente o excesso médio, e emplaque as células na densidade otimizada, em triplicado, nos poços apropriados da placa revestida de matriz extracelular, e em uma placa adicional não revestida de 96 poços. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular durante a noite. Na manhã seguinte, coloque a placa de ensaio de migração não revestida no suporte da placa base da ferramenta de arranhão e use as dowels guiantes para colocar cuidadosamente a parte superior do suporte sobre a base.
Pressione e segure a alavanca preta enquanto levanta cuidadosamente o bloco do pino para fazer os arranhões. Os arranhões em cada poço devem ser visíveis a olho nu, bem como sob o microscópio. Em seguida, lave a placa uma ou duas vezes com meio de cultura pré-aquecido para remover quaisquer células ou folhas de células separadas.
Para o ensaio de invasão, arranhe a placa revestida como apenas demonstrado. Depois de remover quaisquer células e folhas separadas, use uma caixa fria pré-refrigerada para equilibrar a placa em quatro graus Celsius por cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente o meio frio. Em seguida, adicione 50 microliters de gel de matriz extracelular diluído nos poços apropriados e coloque a placa na incubadora de cultura celular por trinta minutos.
Bolhas são comuns quando se trabalha com gel de matriz extracelular, mas podem ser eliminadas aspirando 70% de etanol. Em seguida, adicione 100 microliters de meio fresco e quente, com ou sem o composto de teste, aos poços apropriados da placa de ensaio de migração ou invasão, e coloque a placa na plataforma de imagem celular viva. Para limpar a ferramenta de risco, coloque o bloco de pinos superiores em barcos individuais de lavagem de 45 mililitros, contendo 5% de detergente, um por cento de detergente dois, água destilada estéril ou 70% de etanol por cinco minutos por lavagem antes de colocar a ferramenta de risco de volta em sua placa base, para armazenamento em um ambiente sem poeira.
Para a imagem dos ensaios da ferida, depois de permitir que a placa se equilibre por cinco minutos, selecione o tipo de vaso como o plano de registro de imagem e defina o tipo de varredura como ferida de arranhão. Selecione ou edite o padrão de varredura, de acordo com a configuração da placa experimental, e agende 24 horas de repetição a cada uma ou duas horas durante 72 horas, ou até que as feridas sejam curadas como demonstrado. Quando todas as feridas tiverem cicatrizado, pare a varredura e selecione de três a seis imagens representativas, abrangendo uma série de percentagens sonoras, incluindo imagens logo após a ferida ter sido feita, e fechamento da ferida em 10 e 50%.
Para determinar uma definição adequada de processamento, aplique uma máscara de ferida de arranhão apropriada e uma máscara de confluência como demonstrado, e use a corrente de visualização all'to ver a precisão das máscaras. Então, inicie o trabalho de análise. Em um ensaio de migração, a largura da ferida é a distância média entre as folhas celulares ao lado da ferida.
A confluência da ferida é a confluência dentro da área ferida. A confluência inicial de ferida ideal deve ser próxima de zero por cento. A densidade relativa da ferida e a confluência da ferida sugerem a velocidade das células que ocupam a área da ferida de arranhão.
Esses dados quase se sobrepõem em ambas as linhas celulares representativas. Diferentes linhas celulares demonstram habilidades de cicatrização de feridas muito diferentes, indicando habilidades migratórias diferenciais entre as linhas celulares. Por exemplo, a lamellipodia é observada nesta linha celular de adenocarcinoma mamário na frente de migração no início da migração, enquanto esta linha de células cancerígenas de mama produtora de mucina não exibiu nenhum sinal de migração celular ao mesmo tempo.
Além disso, a densidade relativa da ferida da linha de adenocarcinoma mamário foi saturada após 50 horas, enquanto a densidade relativa da ferida da linha de células cancerígenas de mama produtora de mucina 1 não mudou com o tempo, ressaltando o fenótipo altamente invasivo das células adenocarcinoma e a não invasiva das células cancerígenas de mama produtoras de mucina 1. As células de adenocarcinoma também se comportaram de forma diferente enquanto invadiam o gel da matriz extracelular, demonstrando uma morfologia alongada com saliências líderes, e em ensaios migratórios, um bleb na frente migratória foi visualizado. Ao emplacar, lembre-se que se poucas células forem semeadas, o arranhão não se formará adequadamente, e se muitas células forem semeadas, haverá superlotação.
Após este procedimento, podem ser adicionados tratamentos de pista, permitindo que este método seja adaptado para triagem de faixa de alto rendimento. Esse método permite que os pesquisadores realizem esses ensaios em uma única plataforma, que é de alto rendimento, e permite que os pesquisadores monitorem suas células em tempo real, em vez de em ponto final experimental. Os desinfetantes utilizados para esterilizar a ferramenta de arranhão podem ser perigosos.
Certifique-se de coletar e descartar as soluções de acordo com o MSDS relevante e as linhas de gatilho regulares de sua instalação.
