Этот метод описывает методику изучения ремоделирования мембран при миграции нейтрофилов у живого животного с помощью прижизненной субклеточной микроскопии. Этот протокол обеспечивает уникальный подход к изучению динамики мембран во время миграции животных в физических условиях, а также к незадействованию микроокружения тканей. Этот метод может быть адаптирован для решения проблемы ремоделирования мембран и динамического перемещения органов цитоскелета, а также мембранного транспорта в различных типах клеток и мигрирующих клетках.
Для начала добавьте зеленый флуоресцентный краситель в суспензию нейтрофилов, очищенную от мышей дикого типа в 1,5 миллилитрах тюбика, покрытого BSA. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании в ротаторе с трубкой. Дайте три промывки с использованием HBSS, затем центрифугирование при 400 G при комнатной температуре в течение пяти минут и повторное взвешивание гранулы в одном миллилитре сбалансированного солевого раствора Hanks'Balanced.
Поместите эту суспензию в пробирку с покрытием BSA в ротатор трубки при легком перемешивании до процедуры инъекции. Перед инъекцией клеточную гранулу ресуспендируют в физиологическом растворе до плотности от 2 до 5 миллионов клеток на 20 микролитров. Переложите животное, находящееся под наркозом, на грелку с температурой 37 градусов по Цельсию для поддержания температуры его тела.
После проверки рефлекса отвода лапы удалите волоски из уха с помощью тонкого триммера для оптимизации качества изображения. Положите животное на бок, возьмитесь за край уха и расплющите его вдоль грелки с помощью хирургической ленты, затем наполните шприц, оснащенный иглой 33 калибра, суспензией нейтрофилов и установите его на микроманипулятор. Аккуратно двигайте иглу по направлению к уху, и медленно прокалывайте кожу.
Как только игла окажется внутри кожи, медленно надавите на поршень и введите два-три микролитра клеточной суспензии. После тщательного повторения инъекции на две-три разные области уха осторожно снимите хирургическую ленту и дайте животному прийти в сознание под наблюдением. Дайте животному отдохнуть в течение одного часа перед визуализацией, чтобы ткани и клетки восстановились после процедуры инъекции.
Убедитесь, что микроскоп включен, а предметный столик и линзы предварительно нагреты до 37 градусов Цельсия, прежде чем поместить животное под наркозом на предметный столик для микроскопа. Закройте отверстие в сцене стеклянным покровным стеклом. Осторожно переместите животное под наркозом на сцену.
Если визуализация планируется более чем на час, нанесите офтальмологическую мазь и закрепите перфузионную систему на основе крылатой инфузии. Капните каплю физиологического раствора в центр покровного стекла, а сверху поместите в ухо, введенное нейтрофилами. Аккуратно прижмите ухо стерильной ватной палочкой по центру покровного стекла, чтобы удалить воздушные карманы.
Закрепите ухо, аккуратно прижав деревянную палочку к боковой стороне уха ближе к голове животного и зафиксировав ее с помощью скотча. Затем найдите интересующую область с помощью окуляра микроскопа и переключитесь в режим многофотонной съемки. Установите длину волны лазерного возбуждения на 900–930 нанометров, чтобы обеспечить одновременный сбор зеленого флуоресцентного красителя, mTomato и коллагена-I.
Затем установите соответствующий набор зеркал и комбинации фильтров на детекторах для сбора излучаемого света. Определите параметр, наиболее подходящий для конфигурации оборудования. Даже если мигрирующие клетки можно отследить с интервалом от 30 секунд до одной минуты, субклеточные события можно визуализировать с более высокой скоростью, составляющей, по крайней мере, менее десяти секунд.
В классическом прижизненном подходе микроскопии используйте 30-кратный объектив и сканер Galvo с размером изображения 512 на 512 пикселей для отслеживания миграции клеток и исследования ткани мыши-хозяина, а также установите смещение оси Z с помощью моторизованного столика с шагом два микрометра, чтобы можно было получать изображение объема глубиной 30 микрометров каждые 30 секунд. В прижизненной субклеточной микроскопии используйте 40-кратную линзу и резонансный сканер с трехкратным усреднением для получения изображения высокодинамичного ремоделирования мембраны с более высоким увеличением и разрешением. Также установите смещение по оси Z с помощью пьезо с шагом в один микрометр, что позволяет получать объемную визуализацию глубиной 20 микрометров каждые четыре-пять секунд.
Вызвать стерильную лазерную травму для запуска миграции нейтрофилов путем фокусировки мощного возбуждающего лазера на узкой области 20 на 20 микрометров в течение 10 секунд. Определите лазерную травму по ее сильным автофлуоресцентным сигналам, появляющимся во всех каналах, и по результирующему изменению расположения коллагена. Сохраните данные в конце эксперимента для дальнейшего анализа.
Мышь-реципиент позволила визуализировать структурные особенности в тканях уха, такие как кровеносные сосуды, резидентные клетки и волосяные фолликулы, с помощью подхода, основанного на прижизненной микроскопии. Лазерные повреждения были легко визуализированы благодаря их сильной автофлуоресценции, обнаруженной во всех каналах, а также изменениям расположения коллагена. Полное представление трехмерной архитектуры кожи и локализации введенных нейтрофилов изображает Z-стек кожи от внешнего до внутреннего слоев в трехмерном объемном рендеринге.
Покадровая визуализация показала, что нейтрофилы берут образцы кожи уха и взаимодействуют с внутриклеточным матриксом и тканями хозяина. С помощью прижизненной субклеточной микроскопии наглядно визуализируется динамическое ремоделирование плазматической мембраны во время миграции, образование выступов мембраны на переднем крае, ретракция задней части клеток. Покадровая съемка показывает сложность взаимодействий с внутриклеточным матриксом.
Локальная динамика плазматической мембраны анализировалась с помощью алгоритма pipeline на основе идентификации 100 граничных точек, лежащих под поверхностью клетки. Изменения локальной кривизны и площади, подчеркнутой выступами плазматической мембраны, были рассчитаны для каждой граничной точки и представлены для каждого таймфрейма в виде кимографов. Как передняя, так и задняя части клеток сохраняют более высокую кривизну, чем боковые стороны ячеек.
Негативные изменения области более заметны в задней части клеток, чем на переднем крае, где положительные изменения области более заметны. После визуализации ткань может быть собрана, зафиксирована и обработана для окрашивания для дальнейшей оценки интересующей цели и выяснения механизмов. Эта процедура, разработанная для визуализации динамики мембраны, может быть адаптирована для решения более широкого вопроса клеточной биологии в различных типах клеток и мигрирующих клетках в их соответствующей среде.
