Kanser hücresi hareketliliği metastaz ın başlaması için çok önemlidir. Bu nedenle, hücre hareketi ve tümör hücrelerinin invaziv kapasite nin araştırılması büyük ilgi çekicidir. Kanser hücresi göç ve invazyonunu gerçek zamanlı olarak tek bir platformda araştırmak için kullanılan bu entegre yöntem, hücre hareketliliği ve patolojisi için kolayca tekrarlanabilir ve zaman açısından verimli bir seçenek sunmaktadır.
Bu yöntem, ekstra-hücreli matris yoluyla, kanser hücresi invazyonu içine fikir sağlayabilir ve diğer hücre tipleri uygulanabilir. En uygun sıfırdan alma süresini elde etmek için, tohumlama yoğunluğunun optimize edilmiş olduğundan emin olun ve hücre monokatmanı yüzde 100 birleştiğinde kuluçka süresini uzatmayın. Bir geçiş teşpini için en uygun tohumlu hücre sayısını belirlemek için, hücreleri 96 duvarlı bir plakanın üç aylık aralıklarında yoğunluklara yerleştirin.
Plakayı canlı hücre görüntüleyicisine yerleştirin ve görüntüleyici yazılımındaki görev listesinden zamanlama taramalarını seçin. Çekmece kurulum bölmesinde, plakanın konumlarını belirleyin ve plaka türünü seçmek için damar ekle'yi tıklatın. Tbmkasyon bölmesinde, deneme plaka kurulumuna göre tbmkasyon deseni seçin veya düzenleve tarama türünü standart olarak ayarlayın.
Zaman çizelgesine sağ tıklayın ve ayarlı aralıkları seçin. Daha sonra 24 saat boyunca her iki saat boyunca taramaları ekleyin ve uygula'yı tıklatın. 24 saat sonra, deneysel plakanın seçilmesini sağlamak için çekmece kurulumuna açın ve damarı kaldır'a tıklayın.
Üç ila altı temsili resim seçin ve bunları yeni bir resim koleksiyonuna yerleştirin. Uygun bir işleme tanımı belirlemek için, uygun bir birleştirme maskesi uygulamak için segmentasyon ayarlaması, temizleme ve filtreler kullanın ve maskelerin doğruluğunu görüntülemek için önizleme akımı all'ı kullanın. Analiz işini başlatın ve geçiş tahlillerinin ne zaman başladığına bağlı olarak, zamana karşı yaklaşık yüzde 100 birleştiği zamana göre, altı ila on sekiz saat içinde optimize edilmiş bir hücre yoğunluğu belirleyin.
Ardından, zamana karşı bir hücre çoğalma eğrisi oluşturmak için otomatik olarak toplanan yüksek tanımlı faz kontrast görüntülerine birleştirme işleme çözümleme aracını uygulayın. Teşbebaşlamadan önce, ekstrasellüler matris jel 50 mikrolitre ile işgali analizi için plaka kat, buz gibi hücre kültürü orta seyreltilmiş, mililitre konsantrasyonu başına 100 mikrogram. Sonra, bir hücre kültürü kuluçka gece plaka yerleştirin.
Ertesi öğleden sonra, yavaşça aşırı orta aspire, ve plaka hücreleri optimize yoğunlukta, triplicate, ekstrasellüler matris kaplı plaka uygun kuyulara, ve ek bir kaplamasız 96-iyi plaka içine. Sonra, bir gecede hücre kültürü kuluçka içine plakaları yerleştirin. Ertesi sabah, kaplamasız geçiş istinat plakasını kazıma aracının taban plakası tutucuya yerleştirin ve tutucunun üst kısmını dikkatlice tabanına yerleştirmek için kılavuz dübelleri kullanın.
Çizikler yapmak için pim bloğunu dikkatlice kaldırırken siyah kolu bastırın ve tutun. Her kuyudaki çizikler çıplak gözle görülebilmeli, mikroskop altında da. Daha sonra, herhangi bir müstakil hücre veya hücre yaprak kaldırmak için önceden ısıtılmış kültür ortamı ile plaka bir veya iki kez yıkayın.
İstila tadına göre, kaplamalı tabağı az önce gösterildiği gibi çizin. Herhangi bir müstakil hücreleri ve sayfaları çıkardıktan sonra, soğuk ortamı dikkatlice aspire etmeden önce plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca dengelemek için önceden soğutulmuş soğuk bir kutu kullanın. Daha sonra, uygun kuyulara seyreltilmiş ekstrasellüler matriks jel 50 mikrolitre ekleyin ve otuz dakika boyunca hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.
Kabarcıklar ekstrasellüler matris jel ile çalışırken yaygındır, ama yüzde 70 etanol spirating tarafından ortadan kaldırılabilir. Daha sonra 100 mikrolitre taze, sıcak ortam ekleyin, test bileşiği ile veya test bileşiği olmadan, göç veya istila test plakasının uygun kuyularına, ve plakayı canlı hücre görüntüleme platformuna yerleştirin. Çizik aleti temizlemek için, yüzde 5 deterjan bir, yüzde bir deterjan iki, steril distile su veya yıkama başına yüzde 70 etanol içeren tek tek 45 mililitrelik yıkama tekneleri üst pin blok yerleştirin geri taban plakası üzerine koymadan önce, tozsuz bir ortamda depolamak için.
Yara tahlillerinin görüntülenmesi için, plakanın beş dakika boyunca dengede durmasını sağladıktan sonra, görüntü günlüğü düzlemi olarak damar tipini seçin ve tazyik türünü çizik yarası olarak ayarlayın. Deneysel plaka kurulumuna göre tarama desenini seçin veya düzenleyin ve 72 saat boyunca her 1-2 saatte bir veya yaralar gösterildiği gibi iyileşene kadar 24 saat tekrar taramayı zamanlayın. Tüm yaralar iyileştiğinde, tazyimeyi durdurun ve yara yapıldıktan hemen sonraki görüntüler de dahil olmak üzere bir dizi ses yüzdesini kapsayan ve yaranın yüzde 10 ila 50 oranında kapanması nı içeren üç ila altı temsili görüntü seçin.
Uygun bir işleme tanımı belirlemek için, uygun bir çizik yara maskesi ve gösterildiği gibi bir kesişme maskesi uygulayın ve maskelerin doğruluğunu görüntülemek için önizleme akımı all'ı kullanın. Sonra, analiz işini başlatın. Bir geçiş tdoğru, yara genişliği yara nın yanındaki hücre sayfaları arasındaki ortalama mesafedir.
Yara nın birleşimi yaralı bölgenin kesiştiği yerdir. İdeal ilk yara birleşimi yüzde sıfıra yakın olmalıdır. Göreceli yara yoğunluğu ve yara birleştiği yer, çizik yarası alanını işgal eden hücrelerin hızını göstermektedir.
Bu veriler, bu temsili hücre satırlarının her ikisinde de neredeyse çakışıyor. Farklı hücre çizgileri çok farklı yara iyileşme yeteneklerini gösterir, hücre hatları arasındaki farklı göç yeteneklerini gösterir. Örneğin, lamellipodia göçün başlangıcında göç cephesinde bu meme adenokarsinom hücre hattında görülürken, bu müsin 1 üreten meme kanseri hücre hattı aynı anda hücre göçü belirtisi göstermez.
Ayrıca, meme adenokarsinom hattının göreceli yara yoğunluğu 50 saat sonra doymuş, müsin 1 üreten meme kanseri hücre hattının göreceli yara yoğunluğu zaman içinde değişmeyerek, adenokarsinom hücrelerinin son derece invaziv fenotip ve müsin 1 üreten meme kanseri hücrelerinin non-invazivliği altını çizerek. Adenokarsinom hücreleri de hücre dışı matris jel ilerken farklı davranarak, önde gelen çıkıntılarla uzatılmış bir morfoloji sergilediler ve göç tahlillerinde göç cephesindeki bir bleb görselleştirildi. Kaplama yaparken, çok az hücre tohumlu ise, çizik düzgün oluşmayacak ve çok fazla hücre tohumlu ise, aşırı kalabalık olacağını unutmayın.
Bu prosedürütaki takip teskometleri eklenebilir ve bu yöntemin yüksek iş lenme li parça taraması için uyarlanmasına olanak sağlar. Bu yöntem, araştırmacıların bu tahlilleri yüksek iş kadar yüksek olan tek bir platformda gerçekleştirmelerine olanak tanır ve araştırmacıların deneysel bitiş noktası yerine hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemelerine olanak tanır. Çizik aletinin sterilizasyonunda kullanılan dezenfektanlar tehlikeli olabilir.
Çözümleri ilgili MSDS'ye ve tesisinizin düzenli tetik hatlarına göre topladığınızdan ve elden çıkardığınızdan emin olun.
