암 세포 이동성은 전이의 개시에 매우 중요합니다. 따라서, 세포 이동및 종양 세포의 침습적 용량의 조사는 큰 관심사입니다. 암 세포 이동 및 침입을 실시간으로 단일 플랫폼에서 조사하기위한이 통합 방법은 세포 이동성 및 병리학을 연구하기위한 쉽게 재현 가능하고 시간 효율적인 옵션을 제공합니다.
이 방법은 세포 외 매트릭스를 통해 암 세포 침입에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 다른 세포 유형에 적용 될 수 있습니다. 최적의 스크래치 시간을 달성하기 위해 세포 단층이 100% 합류에 도달하면 시드 밀도가 최적화되었는지 확인하고 잠복기 기간을 연장하지 마십시오. 마이그레이션 분석에 대한 시드 셀의 최적 수를 결정하려면 96벽 판에 삼중구에 있는 밀도의 범위에 세포를 배치합니다.
플레이트를 라이브 셀 이미저에 넣고 이미저 소프트웨어의 작업 목록에서 일정 검사를 선택합니다. 서랍 설정 창에서 플레이트의 위치를 결정하고 용기 추가를 클릭하여 플레이트 유형을 선택합니다. 스캔 설정 창에서 실험판 설정에 따라 스캔 패턴을 선택 또는 편집하고 스캔 유형을 표준으로 설정합니다.
타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 설정된 간격을 선택합니다. 그런 다음 24시간 동안 2시간마다 스캔을 추가하고 적용을 클릭합니다. 24시간 후, 서랍 설정을 열어 실험판을 선택하고, 제거 용기를 클릭합니다.
3~6개의 대표 이미지를 선택하고 새 이미지 컬렉션에 배치합니다. 적절한 처리 정의를 확인하려면 세분화 조정, 정리 및 필터를 사용하여 적절한 인플루언서 마스크를 적용하고 미리 보기 전류를 사용하여 마스크의 정확도를 확인합니다. 분석 작업을 시작하고 마이그레이션 분석이 시작되는 시기에 따라 6~18시간 이내에 시간에 대해 대략 100% 합류에 따라 최적화된 세포 밀도를 결정합니다.
그런 다음, 응력 처리 분석 도구를 자동으로 수집된 고화질 상 대비 이미지에 적용하여 시간에 대한 세포 증식 곡선을 생성한다. 분석을 시작하기 전에, 얼음 차가운 세포 배양 배지에서 희석된 세포외 매트릭스 젤의 50 마이크로리터로 침략 분석용 플레이트를 밀리리터 농도당 100 마이크로그램으로 코팅한다. 그런 다음, 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓는다.
다음 날 오후, 여분의 배지를 부드럽게 흡인시키고, 셀룰러 매트릭스 코팅 플레이트의 적절한 우물로, 최적화된 밀도로 세포를 플레이트, 코팅되지 않은 96웰 플레이트로 플레이트한다. 그런 다음, 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓는다. 다음 날에는 코팅되지 않은 이온 분석판을 스크래치 도구의 베이스 플레이트 홀더에 넣고 안내 다웰을 사용하여 홀더의 상단을 조심스럽게 베이스에 배치합니다.
조심스럽게 스크래치를 만들기 위해 핀 블록을 들어 올리는 동안 검은 레버를 누르고 잡아. 각 우물의 긁힘은 육안으로뿐만 아니라 현미경으로 볼 수 있어야합니다. 이어서, 플레이트를 미리 따뜻하게 한 배양 배지로 1~2회 세척하여 분리된 세포 나 세포 시트를 제거한다.
침략 분석의 경우, 방금 입증 된 바와 같이 코팅 된 접시를 긁습니다. 분리된 세포와 시트를 제거한 후, 차가운 배지를 조심스럽게 채도하기 전에 5분간 섭씨 4도에서 접시를 평형화하기 위해 미리 차가운 냉각 상자를 사용하십시오. 다음으로, 희석된 세포외 매트릭스 젤 50마이크로리터를 적절한 우물에 넣고 30분 동안 세포 배양 배양 배양소에 판을 넣습니다.
거품은 세포외 매트릭스 젤로 작업 할 때 일반적이지만 70 %의 에탄올을 흡입하여 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 신선하고 따뜻한 매체를 시험 화합물의 유무에 관계없이 마이그레이션 또는 침입 분석 플레이트의 적절한 우물에 추가하고 플레이트를 라이브 세포 이미징 플랫폼에 배치합니다. 스크래치 도구를 청소하려면 상단 핀 블록을 개별 45 밀리리터 워시 보트에 배치하여 5% 세제 1개, 세제 2개, 멸균 증류수 또는 70% 에탄올을 세척당 5분 동안 넣은 후 스크래치 도구를 베이스 플레이트에 다시 배치하여 먼지가 없는 환경에서 보관하십시오.
상처 스캔을 이미징하기 위해 플레이트가 5분 동안 평형화할 수 있도록 허용한 후, 이미지 로그 평면으로 용기 유형을 선택하고 스캔 유형을 스크래치 상처로 설정합니다. 실험판 설정에 따라 스캔 패턴을 선택하거나 편집하고, 72시간 동안 1~2시간마다 24시간 반복 스캐닝을 예약하거나, 상처가 입증된 대로 치유될 때까지 는 24시간 씩 반복스캔을 예약한다. 모든 상처가 치유되면 스캔을 중단하고 3~6개의 대표적인 이미지를 선택하여 상처가 만들어진 직후의 이미지를 포함하여 다양한 사운드 백분율을 선택하고 상처가 10~50% 증가합니다.
적절한 처리 정의를 확인하려면 적절한 스크래치 상처 마스크와 인플루언스 마스크를 시연한 대로 적용하고 미리 보기 전류를 사용하여 마스크의 정확도를 확인합니다. 그런 다음 분석 작업을 시작합니다. 마이그레이션 분석에서 상처 폭은 상처 옆의 세포 시트 사이의 평균 거리입니다.
상처 합류는 상처 부위 내의 합류입니다. 이상적인 초기 상처 합류는 0%에 가깝습니다. 상대적인 상처 밀도와 상처 합류는 상처 부위를 차지하는 세포의 속도를 시사합니다.
이러한 데이터는 이러한 대표적인 세포주 모두에서 거의 겹칩니다. 다른 세포주는 세포주 사이의 차동 철새 능력을 나타내는 매우 다른 상처 치유 능력을 보여줍니다. 예를 들어, 라멜리포디아는 이이동의 시작 부분에서 이선전방에서 이 유방 아데노암 세포주에서 관찰되는 반면, 이 뮤신 1-생산 유방암 세포주는 동시에 세포 이동의 흔적을 나타내지 않았다.
또한, 유방 아데노암 라인의 상대적 상처 밀도는 50시간 후에 포화되었지만, 뮤신 1-생산 유방암 세포선의 상대적 상처 밀도는 시간이 지남에 따라 변하지 않았고, 아데노암 세포의 고침적인 표현형과 무신 1-유방암 세포의 비침습성을 강조했다. 아데노암 세포는 또한 세포외 매트릭스 젤을 통해 침입하는 동안 다르게 행동하고, 주요 돌출부를 가진 길쭉한 형태를 보여주고, 이주 삽에서, 이주 전면에 있는 출혈이 시각화되었습니다. 도금 할 때, 너무 적은 세포가 시드되는 경우, 스크래치가 제대로 형성되지 않습니다 기억, 너무 많은 세포가 시드되는 경우, 과밀이있을 것입니다.
이 절차에 따라 트랙 트리트먼트를 추가하여이 방법을 높은 처리량 트랙 스크리닝에 적용 할 수 있습니다. 이 방법을 통해 연구자들은 높은 처리량인 단일 플랫폼에서 이러한 검사를 수행할 수 있으며, 연구자가 실험적인 엔드포인트가 아닌 실시간으로 세포를 모니터링할 수 있도록 합니다. 스크래치 도구를 살균하는 데 사용되는 소독제는 위험할 수 있습니다.
관련 MSDS 및 시설의 정기적인 트리거 라인에 따라 솔루션을 수집하고 폐기해야 합니다.
