Используя этот протокол, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка. Очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих по сравнению с очисткой in vitro сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней при более рентгенологических условиях. Начните с добавления 1,5 миллилитров восстановленной сывороточной среды в три 15-миллилитровые центрифужные трубки.
Добавьте плазмидную ДНК, готовую к трансфекции, в каждую трубку и добавьте 0,2 мкг зеленой флуоресцентной плазмиды белка для контроля эффективности трансфекции. Добавьте 78 микролитров реагента трансфекции липосом к 4,5 миллилитрам восстановленной сывороточной среды в другой центрифужной трубке для разбавления липосом. Тщательно перемешайте, щелкнув тюбиком, а затем дайте ему постоять в течение пяти минут при комнатной температуре.
Добавьте 1,5 миллилитра разбавленного раствора липосом в каждую пробирку, содержащую 1,5 миллилитра разбавленного раствора ДНК. Тщательно перемешайте и смешайте плазмиды с липосомами в течение не менее 20 минут при комнатной температуре. Отбросьте исходную среду из чашки Петри и добавьте в каждую чашку девять миллилитров восстановленной сывороточной среды.
Добавьте три миллилитра смеси ДНК липосом и перемешайте раствор, осторожно встряхнув пластину вперед и назад три раза, а затем влево и вправо три раза для равномерного распределения смеси по пластине. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Замените среду через четыре-шесть часов и продолжайте культивировать клетки в течение 24-36 часов.
Через 24-36 часов обработайте клетки MG132 в конечной концентрации 10 микромоляров в течение четырех-шести часов. Выбросьте среду и дважды промойте ячейки ледяным холодом PBS. Добавьте в блюдо один миллилитр PBS.
Удалите ячейки, соскоблив их чистым скребком и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные трубки. Центрифуга на 700 г в течение пяти минут для сбора гранул клеток. Добавьте 800 микролитров ледяного буфера лизиса FLAG, дополненного коктейлем ингибитора протеазы, к клеткам в каждой трубке.
Смешайте ячейки с помощью вихревого генератора или пипетки, а затем инкубируйте смесь на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Ультразвуком нанесите смесь на лед с каждым импульсом продолжительностью в одну секунду и подвергайте смесь от пяти до 10 коротких импульсов. Инкубируйте смесь на ротаторе при 40 об/мин в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем центрифугируют ультразвуковые образцы при 8 000 G в течение 20-30 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку. Aliquot 80 микролитров клетки извлекают и смешивают с 20 микролитрами 5X SDS нагрузочного буфера.
Кипятите образцы при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут. Остудить на льду в течение двух минут и хранить при минус 20 градусах Цельсия до использования. Используйте эти образцы в качестве входной группы для мониторинга экспрессии белка.
Затем добавьте 30 микролитров конъюгированных шариков антитела АНТИ-FLAG M2 к оставшимся клеточным экстрактам и инкубируйте на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение не менее четырех часов или на ночь. Центрифуга при 1 500 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для сбора бусин. Добавьте один миллилитр ледяного буфера лизиса FLAG к шарикам и перемешайте, перевернув трубку несколько раз.
Повторите этот шаг четыре-шесть раз, затем добавьте 40 микролитров пептидов FLAG в конечной концентрации 200 нанограммов на микролитр к шарикам. Инкубируйте на ротаторе в течение двух часов, как показано ранее, а затем центрифугируйте при той же температуре. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку и добавьте 10 микролитров 5X SDS нагрузочного буфера.
Отварите смесь при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите ее на льду в течение двух минут. Добавьте один миллилитр ледяного холодного PBS в гранулы ячейки и равномерно перемешайте. Aliquot 100 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку в качестве входного образца и центрифугу при 700 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для сбора гранул ячейки.
Добавьте 80 микролитров буфера лизиса FLAG к входному образцу и перемешайте ячейки с помощью вихревого генератора, как показано ранее. Лизируйте клетки на льду в течение одного часа, а затем снова центрифугируйте в течение 20-30 минут. После центрифузии аликвот 80 микролитров супернатанта в новую микроцентрифужную трубку и добавляют 20 микролитров 5X SDS нагрузочного буфера к супернатанту.
Кипятите смесь при 98 градусах Цельсия в течение пяти-10 минут, а затем охладите на льду в течение двух минут. Центрифугируйте оставшиеся 900 микролитров клеточной суспензии при 700 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать гранулу ячейки. Добавьте один миллилитр буфера убиквитина 1 к гранулам клеток и перемешайте путем пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы равномерно распределить клетки.
Подвергайте клетку лизатам до 10-20 раундов ультразвуковой обработки на льду до тех пор, пока раствор не перестанет быть вязким, а затем центрифугируют раствор. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку и добавьте к нему 30 микролитров никелевой смолы. Инкубировать на ротаторе при 15 об/мин в течение четырех часов или на ночь при комнатной температуре, а затем центрифугу в течение двух минут.
После центрифузии соберите шарики и добавьте в него один миллилитр буфера убиквитина 1. Инкубировать с вращением в шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем снова центрифугировать при 1 500 г в течение двух минут, как показано ранее. Добавьте один миллилитр буфера убиквитина 2 к шарикам и выполните инкубацию с последующим центрифугированием, как показано ранее, для сбора шариков.
Повторите этот шаг один раз. Затем добавьте один миллилитр PBS в шарики и следуйте той же процедуре инкубации и центрифугирования для сбора шариков. Повторите этот шаг еще раз.
Элюируют связанные белки путем инкубации шариков с 40 микролитрами имидазола в конечной концентрации 0,5 моляра в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации центрифугируют снова по 1 500 г в течение двух минут. Перенесите супернатант в чистую микроцентрифужную трубку и добавьте 10 микролитров 5X SDS загрузочного буфера.
Кипятите раствор при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите его на льду в течение двух минут. Разрешите образцы с помощью SDS-PAGE, а затем перенесите их на нитроцеллюлозную мембрану с помощью вестерн-блоттинга для обнаружения целевых белков с использованием соответствующих антител. Запустите систему визуализации хемилюминесценции для обнаружения сигналов от западного блоттинга.
Поместите нитроцеллюлозную мембрану в камеру-обскуру лицевой стороной вверх. Равномерно кодируйте раствор подложки на мембране с помощью пипетки. Наконец, выберите автоматическую процедуру экспозиции для захвата хемилюминесцентных сигналов и вручную отрегулируйте время экспозиции до тех пор, пока не будет получен идеальный сигнал.
Общий белок p53, включая убиквитинированный p53, был иммунопреципитирован шариками FLAG M2 из клеток H1299 в условиях отсутствия денатурации. Элуат подвергали вестерн-блоттингу анти-р53 и антигемагглютинином или анти-р53 и моноклональными антителами. Здесь сырые клеточные экстракты или входные данные подвергались западному блоттингу анти-p53 и анти-MDM2 моноклональными антителами.
Сигнал от убиквитинированного белка р53, который появляется в виде размазанной полосы от низкой до высокой молекулярной массы, был заметно увеличен, когда MDM2 был эктопически экспрессирован в этих клетках. Этот результат говорит о том, что убиквитинированный белок p53 был эффективно очищен из клеток. Затем клетки были лизированы в условиях денатурации.
Общие клеточные убиквитинированные белки были опущены никелевой заряженной смолой, а затем подверглись вестерн-блоттингу анти-р53 и антигемагглютининовыми моноклональными антителами. Убиквитинированный белок р53 был обнаружен с использованием антитела против р53 и антигемагглютинина. Здесь на сырых клеточных экстрактах или входе подвергали вестерн-блоттингу анти-p53 и анти-MDM2 моноклональными антителами.
Результаты показали, что общий уровень убиквитинированного белка не изменился, но уровень убиквитинированного белка p53 был резко увеличен после того, как MDM2 был чрезмерно экспрессирован в этих клетках. Это указывает на то, что общие белки убиквитина, содержащие убиквитинированный р53, эффективно извлекались из клеточных лизатов в условиях денатурации. При попытке этой процедуры не забудьте обработать клетки MG132 перед сбором клеток и ультразвуком правильно обработать клетки на льду для очистки убиквитинированных белков.
