Этот протокол позволяет оценить убиквитилирование конкретного субстрата Е3-лигазой. Мы знаем, что характеристика взаимодействия лигазы и субстрата имеет решающее значение для понимания их функции в клетках. Этот метод не требует дорогостоящих реагентов или сложного оборудования.
Он нуждается в плазмидах и кодировании генов, представляющих интерес, разработке анализа иммунопреципитации с клеточными лизатами и западного пятна для обнаружения убиквитилирования субстрата. Некоторые заболевания человека, такие как рак и неврологические расстройства, связаны с дисрегуляцией Е3-лигазы. Следовательно, идентификация убиквитилирования субстрата специфическим Е3-лигазой может помочь в лечении или диагностике этих заболеваний.
Демонстрацию процедуры проведет Валентин Спаньоль. Для начала вырастите клеточную линию HEK293T до 80-90% слияния в модифицированной среде Eagles от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 100 единицами пенициллина, 100 микрограммами стрептомицина и 0,292 миллиграмма на миллилитр L-глутамина. Затем инкубируют эту культуру при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 5% углекислого газа.
Пропустите клетки путем аспирации среды из чашки для культивирования с помощью серологической пипетки и вымойте их один раз одним миллилитом стерилизованного 1X PBS. Далее отделяют клетки, добавляя один миллилитр раствора трипсина этилендиаминтетрауксусной кислоты и после пяти минут инкубации при 37 градусах Цельсия, повторно суспендируют эти клетки в двух миллилитрах питательной среды с помощью серологической пипетки. Переложите клеточную суспензию в свежую и чистую 15-миллилитровую трубку и центрифугу в 500 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем осторожно удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в трех миллилитрах питательной среды путем пипетки вверх и вниз для получения однородной клеточной суспензии. Затем переложите один миллилитр этой клеточной суспензии в 100-миллиметровую культуральную чашку, обработанную TC, содержащую девять миллилитров питательной среды. Перед трансфекцией сертифицируйте, свободны ли клетки от загрязнения и при достаточном слиянии для переходных трансфекций.
Для каждого трансфекционного образца готовят днк-полиэтилениминовые комплексы, разбавляя три микрограмма каждой плазмиды в 100 микролитрах восстановленной сывороточной среды Opti-MEM 1 без добавок и осторожно перемешивая ее путем пипетирования раствора вверх и вниз. Далее размораживают ДНК-полиэтиленимин при комнатной температуре и добавляют его в раствор, следуя пропорции трех микролитров ДНК-полиэтиленимина на один микрограмм ДНК. Гомогенизируйте раствор путем пипетирования вверх и вниз.
Затем инкубируют его в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование ДНК-полиэтилениминных комплексов. Добавьте общий объем ДНК-полиэтилениминных комплексов в каждую чашку, содержащую культуру клеток, и аккуратно перемешайте ее, раскачивая пластину вперед и назад. Затем инкубируют эти клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе клеточной культуры.
После инкубации и за шесть часов до лизиса клеток обрабатывают трансфектированные клетки ингибитором 10-микромолярной протеасомы MG132 и инкубируют клетки в инкубаторе увлажненной клеточной культуры. Затем аспирируйте среду из каждой чашки культуры с помощью серологической пипетки и промыть клетки один раз одним миллилитром 1X PBS. Затем отсоедините клетки, добавив один миллилитр трипсина и инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Повторно суспендируют клетки в одном миллилитре питательной среды и переносят клеточную суспензию в свежую и чистую двухмиллилитровую микропробирку и центрифугируют ее в 500 раз больше G в течение пяти минут при комнатной температуре. Как только центрифугирование закончится, удалите супернатант, осторожно вылив его и осторожно повторно суспендировав клеточную гранулу в 200 микролитров ледяного буфера лизиса MP40, дополненного коктейлем ингибиторов протеазы и фосфатазы. Затем переложите этот раствор в чистую 1,5-миллилитровую микропробирку.
Инкубируют эту клетку лизатом в течение 30 минут на льду, а после инкубации центрифугируют клетку лизатами в 16 900 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Между тем, уравновешивайте шарики агарозного анти-HA с ледяным буфером лизиса MP40. Используйте 15 микролитров бусин агарозы против ГК для каждого образца.
Вымойте шарики 200 микролитрами буфера лизиса MP40, пульсируя их в микроцентрифужной трубке при 3000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Далее аккуратно аспирируйте и выбрасывайте супернатант пипеткой и повторяйте этот процесс три раза. После этого держите бусины уравновешенными на льду до использования.
После центрифугирования клеточных лизатов восстанавливают супернатант и количественно оценивают содержание белка в общем лизате с использованием метода Брэдфорда, чтобы гарантировать, что каждый образец, подвергнутый иммунопреципитации, представляет равное количество белка. Инкубируют необходимый объем лизата клеток с уравновешенными бусинами агарозного анти-ГК в течение четырех часов, осторожно вращаясь во вращающемся инкубаторе при четырех градусах Цельсия, что позволяет UXT-V2-HA связываться с шариками агарозного анти-ГА. Соберите шарики агарозного анти-ГК, пульсируя их в микроцентрифужной трубке в 3000 раз G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.
Осторожно аспирировать и выбросить супернатант. Трижды вымойте шарики ледяным буфером лизиса MP40 и два раза ледяным буфером FLAG HA. После заключительной промывки аккуратно удалите все надосадочное вещество с помощью пипетки и элюируйте полиубиквитилированный белок 300 микрограммами на миллилитр пептида ГК, разбавленного на буфере FLAG HA.
Инкубируйте бусины агарозного анти-ГК с пептидом ГК в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в качающейся шейкерной платформе. Затем раскрутите шарики в 3000 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удалите супернатант, содержащий полиубиквитинированные белки. При необходимости храните элюент в свежей и чистой микропробирке при минус 20 градусах Цельсия.
Растворяют элюенты и лизаты клеток в 10%-ном додецилсульфате натрия полиакриламидном гелевом электрофорезе и иммуноблоттинге. Чтобы выполнить влажную переносную вестерн-блоттинг, поместите гель в бутерброд для переноса, состоящий из фильтровальной бумаги, фильтровальной бумаги с гелевой мембраной, смазывайте его прокладками и сжимайте его вместе с помощью опорной сетки. Затем поместите эту систему вертикально в резервуар, заполненный передаточным буфером между электродами из нержавеющей стали или платиновой проволоки.
Передача происходит в течение 90 минут при 150 вольтах во влажном буфере переноса. Наконец, исследуйте мембрану иммуноблота, используя антимик-антитела. Специфическое полиубиквитилирование UXT-V2-HA, опосредованное F-бокс-белком 7 в клетках, наблюдалось после зондирования элюента из иммунопреципитации анти-ГК антимик-антителом, которое обнаруживает мик-уб, конъюгированный с субстратом.
Специфичность антимика для полиубиквитилированного субстрата визуализировали в первой и второй полосах, где мазок полиубиквитилированных белков не был обнаружен, когда клетки были котрансфектированы белком F-box 7 и мик-ub в отсутствие плазмиды UXT-V2-HA. Кроме того, мазок, соответствующий полиубиквитинации белка, не был визуализирован в комбинации белка F-box 7 и UXT-V2-HA без плазмиды myc-ub. Когда пустовекторный белок F-box 7 дикого типа или мутант F-box белка 7, неспособный собирать активный SCF, транссектировался в комбинации с UXT-V2-HA и myc-ub, сильный сигнал мазка полиубиквитилированного UXT-V2 наблюдался только для белка F-box 7 дикого типа, предполагая, что UXT-V2 был полиубиквитилирован комплексом SCF F-box белка 7 и клетками по сравнению с контрольной группой.
Этапы монопреципитации, включая инкубацию клеточных лизатов с уравновешенными шариками и элюирование иммунопреципитированных белков, имеют важное значение для достижения цели этого протокола. После этой процедуры следует провести анализ убиквитилирования in vitro для подтверждения специфичности убиквитилирования субстрата лигазой E3.
