Наш протокол обеспечивает высокую пропускную способность метода для скрининга большого количества парных микробных взаимодействий в тандеме для выявления взаимодействий, представляющих интерес, которые могут помочь микробиом исследований и обнаружения противомикробных препаратов. Этот метод легко применим к изучению микробных взаимодействий в различных системах, если микроорганизмы любезны к культуре в лабораторных условиях. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет пользователям экран большое количество микробных взаимодействий в относительно короткий период времени.
Новые пользователи этого метода должны занять время, особенно при инокулации биоанализных пластин, так как очень важно быть осторожным, чтобы свести к минимуму разрастание или загрязнение. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что инокулирование биоанализных пластин требует точности, чтобы убедиться, что организмы не разрастают колодцы, и что со-культуры не загрязнены. Начните с подготовки ночных культур.
Используйте серологическую пипету, чтобы добавить три миллилитров бульона BHI в 14-миллилитровые трубки культуры. Затем используйте стерильный один микролитер инокуляции петли для прививки бактериальной колонии в бульон. Закружить петлю, чтобы убедиться, что комок рассеивается в бульон.
Кратко вихрь культуры труб, и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию на шейкер при 250 об /мин. Как только бактериальные культуры достигают OD 600 выше одного, вихрь их, чтобы разбить скопления клеток. Подготовка PHI средств массовой информации с 1,5%agar, и стерилизовать его путем автоклавирования.
Затем охладить средства массовой информации до 55 градусов по Цельсию в контролируемой температурой водяной бане, и обойтись три миллилитров расплавленного BHI средств массовой информации в каждой из 12 скважин на пластине, гарантируя, что скважины как можно более равномерно. Затем позвольте агару установить на ночь. Прививать испытательный организм на биоанализной пластине, вставив стерильную 10-микролитровую инокулятную петлю в ночную культуру, и полоса культуры капли над левой трети пластины хорошо.
Повторяйте до тех пор, пока все 12 скважин на плите не будут привиты. Инкубировать пластины вверх дном при соответствующей температуре в течение семи дней. Если инкубация при температурах выше или равна 37 градусам по Цельсию, или в более сухом климате, храните пластины во влажном контейнере, чтобы предотвратить их высыхание.
После шестидневной инкубации биоанализной пластины подготовьтесь к ночным культурам организма-мишени, как описано ранее. Подготовьте целевую пластину, заполнив каждую колодец пустой пластиной из 12 колодец с 1,8 миллилитров BHI и 200 микролитров целевой ночной культуры. Поместите стерильный штамп прививки в целевую пластину.
Аккуратно закружить культуры вокруг колодцев, гарантируя, что они не перекрестно загрязняют соседние колодцы. Поднимите прививку штамп, и убедитесь, что есть капля разбавленной целевой культуры на каждом кончике марки. Поместите прививку штамп на неукопленной пластины bioassay, и осторожно рок штамп так, что культура капли прививается каждый хорошо.
После того, как марка удалена, капля культуры должна быть видна в колодцах. Если какие-либо скважины не прививаются с прививкой штамп, месте три микролитера разбавленной ночной культуры на скважины с помощью пипетки. Затем привить биоанализные пластины, как описано ранее, но выровнять печать советы с правой стороны 12-хорошо пластины, гарантируя, что печать не контактирует с существующей бактериальной колонии.
Аккуратно снимите штамп и поместите его обратно в целевую пластину. Если агар затвердевал в колодцах неравномерно, аккуратно раскачивайте штамп вперед и назад, но будьте осторожны, чтобы не сдвинуть штамп в рост испытательного организма. Повторите прививку для каждой биоанализной пластины до тех пор, пока все пластины не будут привиты, а затем инкубировать пластины вверх дном при соответствующей температуре в течение семи дней.
После совместного культивирования испытательного и целевого организма в течение одной недели, оценка взаимодействий на основе визуальной оценки. Оценка скважин с целевым ростом организма, который демонстрирует неотличимый рост от монокультуры, как ноль. Оценка скважин с уменьшением роста, как один, и не рост, как два.
Описанные здесь анализы совместной культуры были использованы для оценки ингибирующей активности актинобактерий испытательных организмов по отношению к видам стафилококков, целевых организмов, изолированных от полости носа человека. Всего было протестировано 812 парных комбинаций. Примечательно, что Corynebacterium propinquum сильно ингибирует коагулазу отрицательных стафилококков, особенно по сравнению с другими коринебактериями, которые либо слабо ингибируют коагулазу, отрицательные стафилококки, либо не имеют ингибирующего воздействия.
С помощью сравнительной геномики в геноме коринебактерий был выявлен биосинтетический генный кластер для производства сайдрофора. Совместное культурное взаимодействие анализы с использованием стандартных и железо-дополненных BHI среды установлено, что ингибирование фенотип между Corynebacterium propinquum и коагулас отрицательных стафилококков на самом деле железо-зависимых. Важно быть осторожным при штамповке пластины.
Двойная проверка каждого хорошо после штамповки, и убедитесь, что прививка штамп выровнен правильно, чтобы предотвратить загрязнение. После выявления взаимодействий, представляющих интерес, последующие исследования с использованием микробной генетики и геномики, естественной изоляции продукта и характеристики, или визуализации масс-спектрометрии могут быть использованы для характеристики механизмов, лежащих в основе этих взаимодействий. Этот протокол недавно был использован для выявления siderophore опосредовано конкуренции между человеком носовой микробиоты, и помогли в открытии новой противогрибковой молекулы под названием цифомицин.
