Этот протокол описывает метод всеобъемлющей, беспристрастной молекулярной характеристики одного образца с использованием как масс-спектрометрии, используя метаболомику, протеомику и липидомику, так и ядерные магнитно-резонансные спектроскопические платформы. Значение этого подхода заключается в том, что мы можем охарактеризовать биологическую систему ниже по течению генома, путем выявления различных типов молекул, что позволяет нам сделать вывод о метаболических и разлагающихся путях. Последовательный метод экстракции, позволяют экстракции биодоступных, полярных соединений с использованием воды, а затем MPLEx для захвата любых дополнительных полярных соединений или метаболитов, а также белков и липидов из одного образца.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку он направляет ученого путем разделения трех слоев во время второго шага извлечения и разделения экстрактов между различными инструментами анализа. Интегративный многоомийный анализ дает возможность более эффективным исследованиям и полному пониманию сложных биологических систем. Этот надежный метод извлекает большое разнообразие молекул и применим к различным типам образцов.
Начните эту процедуру со сбора и подготовки образцов, описанных в текстовом протоколе. Использование этанола мыть, посуда из нержавеющей стали, aliquot 50 миллиграммов каждого из сушеных образцов в отдельных двух миллилитров стеклянных труб. Добавьте по одному миллилитру дистиллированной, дегазированной воды в каждый образец.
Затем крышка флаконы и встряхнуть в течение двух часов на стол шейкер. Центрифуга образцов при 15 тысячах раз больше гравитации в течение 30 минут. А затем позволить решениям стоять при комнатной температуре в течение 20 минут.
Декант и сохранить супернатант из каждого образца. Проведте MPLEx Extraction на теперь извлеченных остатках воды, повторяя эти шаги извлечения. За исключением замены минус 20 градусов по Цельсию четыре-три хлороформа на смесь метанола для дистиллированной, дегазированной воды.
Тщательно отделить два результирующего слоя растворителя, которые будут визуально различимы путем удаления верхнего слоя путем тщательного пипетки. Высушите нижний неполярный слой в фене. Как только он высохнет, добавьте пять микролитров хлороформа и 195 микролитров метанола при анализе в течение ближайших нескольких дней.
Повысить эффективность ионизации электроспрей для четырехкратной ионной циклотронной резонансной масс-спектрометрии, сокращенно FTICR-MS путем прямого впрыска. Разбавить экстракт хлороформа один к одному в метаноле, а воду извлечь два к одному в метаноле. Калибруйте спектрометр FTICR, непосредственно впрысая 100 микролитров тюнингового раствора, охватывающего диапазон масс от 100 до 1300 дальтонов, в FTICR-MS.
Прямая инъекция 100 микролитров стандарта кислоты реки Суванни Fulvic к источнику ионизации электроспрей. В сочетании с спектрометром FTICR через шприц насос установлен на скорость потока 3,0 микролитров в минуту. Установите напряжение иглы до положительных 4,4 киловольт.
Очередь от 1 до 100 масс для зарядки соотношения и стеклянный капилляр при 180 градусах по Цельсию. Осмотрите полученные спектры с помощью программного обеспечения для анализа для подтверждения качества данных. Теперь ввемите 100 микролитров каждого экстракта с помощью прямого впрыска в источник ионизации электроспрей, в сочетании со спектрометром FTICR через шприц-насос, установленный на скорости потока 3,0 микролитров в минуту.
Установите параметры, как и прежде. Отрегулируйте время накопления ионов для каждой выборки или группы образцов с учетом изменения концентрации углерода. Соберите 144 сканирования для каждого образца, среднее сканирование, а затем провести внутреннюю калибровку с помощью гомологичной серии CH2.
Высушите экстракты с помощью концентратора и сохраните оставшуюся часть экстрактов для последующей газовой хроматографии масс-спектрометрии, жидкой хроматографии масс-спектрометрии и анализа ядерной магнитно-резонансной спектроскопии. Чтобы подготовиться к GC-MS, сначала подготовьв пустые образцы управления, подробно описанные в текстовом протоколе. Для защиты карбинол групп добавить 20 микролитров 30 миллиграммов на миллилитр гидрохлорида метоксамина в Парадине в каждом из образцов, в том числе экстракты метанола, экстракты воды, пробелы и образцы калибровки FAME.
Запечатай флаконы шапками. Vortex экстракты в течение 20 секунд, а затем sonicate экстракты в течение 60 секунд. Центрифуга экстрактов при 37 градусах по Цельсию в течение 90 минут при 100-ми степени тяжести.
Добавьте 80 микролитров MSTFA с 1%trimethylchlorosilane к каждому образцу. После вихревого и sonicating экстракты, как и раньше, центрифуга экстракты снова при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут при 100 раз тяжести. После охлаждения экстракты до комнатной температуры, передача в GC-MS autosampler флаконы.
Приступайте к анализу GC-MS и обработке данных, как описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовиться к анализу жидкого состояния ЯМР, разбавьте оставшуюся часть экстрактов воды на 10% с помощью пятимиллярного внутреннего стандарта DSS. Перенесите смесь в высококачественную, трехмиллиметровую трубчатую трубку из стекла NMR.
Приступайте к анализу ЯМР и обработке данных, как описано в текстовом протоколе. Для проведения анализа липидомики LC-MS ввесните 10 микролитров каждого экстракта в сверхвысокую жидкую хроматографию в сочетании с масс-спектрометром Orbitrap с помощью заряженной фазы поверхности гибридной колонки. Установите 34-минутный градиент, перечисленный в текстовом протоколе, со скоростью потока 250 микролитров в минуту.
Используйте как отрицательные, так и положительные режимы ионизации с более высокой диссоциациацией столкновения энергии и диссоциацией, вызванной столкновением. Для выполнения протеомического анализа, первый экстракт белков в соответствии с протоколом MPLEx на оставшуюся часть фазы метанола, как указано в текстовом протоколе. Торф был сравнен с глубиной в болоте S1 на ели и торфяники ответ под изменение окружающей среды или SPRUCE сайте в штате Миннесота, штат США.
3, 312 ферментов были определены в протеомическом анализе. Анализ ферментной деятельности с глубиной показывает, что количество ферментов резко снижается между 15 сантиметров и 45 сантиметров в болоте SPRUCE. Чтобы показать, как сайты могут варьироваться в метаболит и ферментной деятельности, результаты SPRUCE сравниваются с результатами из вечной мерзлоты Бога и Фена в северной Швеции.
В целом 67, 040 метаболитов были выявлены во всех образцах SPRUCE Peat из комбинации анализов FTICR-MS, NMR, GC-MS и LC-MS. Здесь показана относительная доля различных химических классов, выявленных с помощью различных методов на различных глубинах. В то время как аминокислоты и сахара снижаются с глубиной, это не наблюдается для липидов.
Путем перекрестной проверки метаболитов, выявленных во всех анализах в отношении базы данных KEGG было установлено, что выявленные соединения участвуют в общих метаболических путей, таких как трикарбоксилевая кислота цикла, гликолиз и метаболизм сахара. На протяжении всей этой процедуры крайне важно быть в курсе потенциальных источников загрязнения. Начиная со сбора образцов с помощью анализа, образцы не должны со контактировать с привязанными пластмассами, которые могут негативно повлиять на ионизацию.
Многие растворители, используемые во время процедуры извлечения, опасны или легковоспламеняющиеся. Всегда носите соответствующие СИЗ, чтобы избежать контакта кожи и глаз, а также, чтобы избежать загрязнения образцов.
