Данный протокол содержит средства для подготовки рабочего раствора гранул для исследований in vivo, а также подготовки гранулсодержащей сыворотки для экспериментов in vitro. Одним из преимуществ этого метода является то, что метод может быть легко повторен из-за низкой стоимости материалов и животных, которые вы создаете для экспериментов. Начните с добавления 8, 16 и 24 граммов Gushukang, или GSK, гранулы для отдельных 50-миллилитровых труб.
Добавьте 48 миллилитров воды в каждую трубку и встряхните трубки, чтобы полностью растворить гранулы. Затем поместите 1,6 таблетки карбоната кальция, дополненного витамином D3, в другую 50-миллилитровую трубку и растворите таблетки в 48 миллилитров солевого раствора со тряской. Для внутрижелудочественного администрирования растворов, сначала осторожно, но твердо вручную ограничить один месяц, женщина, C57 Черный 6 мыши в течение двух-трех минут.
Когда мышь успокоится, загрузите 40-миллиметровую иглу номер 12 с 0,24 миллилитров одного рабочего раствора гранул GSK и поместите иглу гаважа в мышь через одну сторону рта до тех пор, пока не будет ощущаться сопротивление иглы, указывая, что игла достигла желудка. Ввеснуть весь объем рабочего раствора в животное. Затем, втягивать иглу gavage, и вернуть мышь в свою клетку в то время как другие мыши вводят ГСК до введения 0,24 миллилитров карбоната кальция и витамина D3 раствор в каждой мыши таким же образом.
Для GSK-содержащих крови сбора сыворотки, после доставки соответствующих концентраций ГСК к крысе на gavage, как только что продемонстрировано, подтверждают отсутствие реакции на боль в крайнем случае через час после последнего GSK гранул администрации. Сделайте брюшной кожи и брюшной разрез, и подвергать живота в нижней части грудной клетки. Используйте тканевую бумагу, чтобы удалить соединительной ткани брюшной аорты подвергать сосуд четко, и использовать 10-миллилитровый шприц оснащен 22-го калибра иглы, чтобы извлечь кровь из аорты.
Перенесите кровь в стерильную 15-миллилитровую трубку и поместите трубку в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 30-60 минут. Когда кровь сгустилась, центрифуга трубки, чтобы отделить сыворотку, и передать всю сыворотку до шести крыс в новую 50-миллилитровую трубку. Встряхните трубку, чтобы смешать серу перед инактивации компонентов сыворотки в 56-градусной водяной бане по Цельсию в течение 30 минут.
Затем фильтруем сыворотку через фильтр для хранения при температуре до 80 градусов по Цельсию при температуре до 80 градусов по Цельсию. Для остеокластогенеза in vitro разбавляют три дозы ГСК-содержащей сыворотки в соотношении один к четырем с минимальным средним орла, дополненным L-глутамином, рибонуклеозидами и дезоксирибонуклеозидами. Добавьте 200 микролитров каждого разбавления к каждому колодец макрофаговой культуры костного мозга в 96-колодец пластины.
Затем, инициировать остеокласт поколения, стимулируя каждый колодец с макрофагов колонии стимулирующий фактор и рецептор активатор для ядерного фактора-каппа B лиганд. Для экстракорпорального остеобластогенеза добавьте два миллилитров разбавленной сыворотки, содержащей ГСК, в каждую колодец мезенхимальной культуры стволовых клеток из 24-колодец. Результаты микро-компьютерного сканирования томографии показывают, что овязочные мыши демонстрируют значительную потерю костной массы по сравнению с солевыми контрольными мышами.
Вмешательство с 90 дней лечения гранул ГСК значительно увеличивает плотность костного мозга, особенно в средней дозе ГСК обработанных животных. Лечение гранул GSK также приводит к увеличению трабекулярного числа костей, объему костей над общим объемом и толщине трабекулярной кости, но снижению разделения костно-трабекулярной кости. Тартрат устойчивостью кислоты фосфатазы, или TRAP, окрашивание показывает увеличение числа остеокластов в ovariectomized мышей по сравнению с контрольными животными, в то время как GSK гранул лечения уменьшить TRAP-положительной дифференциации остеокласта по сравнению с ovariectomized животных.
Гранат-содержащая сыворотка GSK также уменьшает количество TRAP-положительных остеокластов по сравнению с сывороткой, собранной у контрольных животных. Успешное проникновение иглы в брюшную аорту имеет решающее значение для гарантии того, что достаточно большой объем крови собирают из каждой крысы. Успешное выполнение этого метода должно выдать накопление от 15 до 20 миллиметров крови, достаточно материала, который будет использоваться для экспериментов в пробирке.
