Клиническое применение тканевой трахеи было ограничено из-за стеноза трансплантата и задержки эпителиализации. Модель мыши ортопедической замены трахеи позволяет изучать клеточные механизмы, вождения регенерации. Долгосрочные дефекты дыхательных путей могут превышать то, что современные методы лечения способны вылечить.
Ткань инженерии трахеи предлагает потенциал для создания замены органа для этих условий. Эта модель может быть применена к животным с трансгенными и линии отслеживания свойств. Затем мы можем модулировать принимающие факторы, способствующие регенерации трансплантата.
Одной из ключевых задач при производстве эшафотов будет измерение и определение того, что параметры электроспынинга одинаковы каждый раз. Таким образом, каждый раз, когда вы производите эшафот, вам нужно измерить наконечник к коллектору расстояние, влажность и температура, чтобы обеспечить леса одинаковы каждый раз. Решающее значение для успеха этой модели является уточнение микрохирургических методов и поддержание правильной плоскости анестезии, чтобы спонтанная вентиляция на протяжении всей процедуры.
Так как трахея хозяина имеет внутренний диаметр около одного миллиметра, трансплантат и родной обработки тканей и шов размещения являются важными и лучше продемонстрировали визуально. Начните с растворения восьми процентов веса полиэтилен терефталат, или ПЭТ, в гексафтороизопропанол и нагрева в результате раствора до 60 градусов по Цельсию. В то время как раствор нагревается, растворить три веса процентов полиуретана, или ПУ, в гексафтороизопропанол, сочетая решения, как только ПЭТ-раствор остынет.
Загрузите 60-миллилитровый шприц, оснащенный иглой из 20-го калибра с полимерной смесью. Используйте шприц и высоковольтный источник питания DC, установленный для положительных 14 киловольт на игле, другой высоковольтный источник питания dc, установленный до минус трех киловольт, скорость потока 5 миллилитров в час и 20-сантиметровое расстояние от кончика до субстрата, чтобы электроспин полимера на одномиллиметровый диаметр стержня из нержавеющей стали, который был повернут на 350 оборотов в минуту. Продолжайте электроспиннинг до тех пор, пока не будет достигнута толщина стены из 300 микрометров.
Затем сдвиньте эшафот с стержня, поместите эшафот под вакуум на ночь, чтобы удалить любой остаточный растворитель, и стерилизовать эшафот с ультрафиолетовой дозировкой света 350 миллиджоулей на сантиметр в квадрате в течение примерно 15 минут. В стерильных условиях, удалить кожу с задних конечностей от шести до восьми недель, женщины, C57-Black/6 мыши с мелкими ножницами и микро-Adson типсы, и использовать Дюмон номер пять типсов и Дюмон номер 5/45 типсов для удаления фасции и сухожилий. Разделите кости, чтобы позволить каждому из них быть разрезаны на обоих концах, и использовать пятими миллилитровый шприц оснащен 25-го калибра иглы, чтобы промыть костный мозг в чашку Петри, содержащую 30 миллилитров RPMI среды.
Когда все кости были промыты, фильтровать костный мозг через 70-микрометровый нейлоновой клетки ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку, и передать трубку в шкаф биобезопасности. Аккуратно добавьте отфильтрованный раствор моноядерных клеток вниз по стороне 15-миллилитровой трубки, содержащей пять миллилитров полисуцера и диатризоата натрия, не смешивая слои, и отделите плазму от белых и красных кровяных телец по плотности градиентного разделения. В конце центрифуги соберите средний ясный слой, состоящий из моноядерных клеток костного мозга, и помойте моноядерные клетки костного мозга по соотношению один к одному в PBS путем центрифугации.
Повторное распределение гранул в пяти миллилитров PBS для второй стирки, а затем повторное успение в 10 миллилитров свежей среды RPMI для подсчета. Затем соберите клетки с дополнительной центрифугации, и разбавить клетки в один раз от 10 до семи клеток на пять микролитров свежей концентрации RPMI. Перед посевной эшафот, сократить полимер до пяти миллиметров длины по мере необходимости, и мокрые леса с пятью микролитров RPMI среды в течение пяти минут.
В конце инкубации удалите излишки среды и загрузите микролитер моноядерного клеточного раствора костного мозга на 10 минут. Затем вставьте 21-калибровочный иглы через люмен эшафота, и поместите трансплантат в один миллилитр RPMI среды ночь в 37-градусный инкубатор по Цельсию. После индукции общей анестезии, подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноца у животного-реципиента и нанесите мазь на глаза животного.
Обрезать волосы на хирургическом участке от подбородка до ключицы, и поместить животное на хирургическую площадку в спинной лежачих положение. Используя асептический метод, дезинфицировать хирургическое место с последовательным povidone-йод, 70% этанола, povidone-йод протрите серии, и переместить мышь под рассечение микроскопа с головой в 12 часов. Используйте тонкие ножницы и микро-Adson тибры, чтобы сделать разрез средней линии от ключицы до гиоидной кости, и использовать Дюмон номер пять и номер семь штраф тибры и стерильный ватный тампон для очистки фасции перед вставкой самоуверждения Colibri втягивания в разрез.
Используйте типсы, чтобы открыть мышцы ремешка, чтобы разоблачить хрящ щитовидной железы, крикоидный хрящ и трахею, и прямо отделить трахею от рецидивирующих нервов ларинга параллельно по обе стороны ткани, а затем окружное отделение трахеи от пищевода. Используя 20-го калибра иглы и хирургического маркера, пятно передней части трахеи. Сделайте разрез ниже третьего кольца трахеального хряща с помощью пары весенних ножниц Vannas-Tubingen и пары Дюмона номер семь тонких типсов, чтобы повторно получить трехко кольцо раздел трахеи.
Держа трахею с тонкой изогнутой щипцей, используйте стерильный 9-0 нейлоновый шов, чтобы обеспечить дистальный конец трахеи к грудине, чтобы создать временную трахеостому, и использовать 20-го калибра иглы и хирургического маркера, чтобы окрашивать переднюю часть трансплантата. Чтобы имплантировать трансплантат, используйте 9-0 стерильных нейлоновых швов, Дюмон номер семь тонких типсов, и держатель иглы, чтобы вставить проксимальной-задней, проксимальной боковой, и проксимальной передней стежки, и превратить животное 180 градусов. Когда мышь находится в положении, отпустите временную трахеостому и сделайте боковой разрез в пяти миллиметрах от передней части трансплантата, чтобы облегчить дистальный антомоз.
Чтобы завершить дистальный анастомоз, поместите швы таким же образом, чтобы проксимальный анастомоз, и повторно приблизить трансплантат позиции и мышцы ремня. Затем закройте разрез 9-0 стерильными нейлоновыми швами в беговой схеме и поместите животное в клетку восстановления, помещенную на грелку с мониторингом до полного выздоровления. Через две недели после имплантации, несколько базальных эпителиальных клеток можно наблюдать базально-клеточного кератина пять и 14 окрашивания в ткани инженерии трахеи трансплантата тканей разделов.
Базальные клетки также обнаруживаются на светимой поверхности трансплантата через семь дней после имплантации. После эксплантации и гистологического анализа, стеноз трансплантата был определен в качестве основного фактора, способствующих трансплантации имплантированных мышей, демонстрирующих признаки дыхательной недостаточности и stridor. Обратите внимание, что телескопирование трансплантата и родной трахеи является распространенным выводом в результате хирургической техники.
Окрашивание для F4/80 показывает макрофаги хозяина в стенотической области трансплантата в сочетании с наличием базальных эпителиальных клеток. Избегайте манипуляций с рецидивирующими нервами ларинга, и убедитесь, что проксимальные и дистальные швы на месте, чтобы герметичное уплотнение при анастомозе. Поскольку этот протокол касается моноядерных клеток костного мозга, полученных из биобезопасности уровня один агент мышей, важно носить соответствующее личное защитное оборудование, чтобы избежать загрязнения.
