יישומים קליניים של קנה הנשימה מהונדס רקמות הוגבלו עקב התעצמות השתל אפיתליזציה מאוחרת. מודל עכבר של החלפת קנה דרך אורתוטופית מאפשר את חקר המנגנונים התאיים המניעים התחדשות. פגמים ארוכים של דרכי הנשימה יכולים לעלות על מה הטיפולים הנוכחיים מסוגלים לרפא.
קנה הנשימה מהונדס רקמות מציע את הפוטנציאל ליצור איבר חלופי עבור תנאים אלה. מודל זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים עם תכונות מעקב מהומן שושלת. לאחר מכן אנו יכולים לווסת את הגורמים המארחים התורמים להתחדשות השתלים.
אחד האתגרים המרכזיים בהפקת הפיגומים יהיה מדידה וקביעה כי הפרמטרים electrospinning זהים בכל פעם. אז בכל פעם שאתה מייצר פיגום, אתה צריך למדוד את המרחק קצה לאספן, הלחות, ואת הטמפרטורה כדי להבטיח את הפיגומים זהים בכל פעם. קריטי להצלחת מודל זה הוא עידון של טכניקות מיקרוכירורגיות ותחזוקה של המישור הנכון של הרדמה כדי לאפשר אוורור ספונטני לאורך כל ההליך.
מאז קנה הנשימה המארח יש קוטר פנימי של סביב מילימטר אחד, השתל טיפול ברקמות ילידים מיקום תפר חשובים והוכח בצורה הטובה ביותר חזותית. התחל על ידי המסת שמונה אחוזי משקל פוליאתילן טרפתאלאט, או PET, ב hexafluoroisopropanol וחימום הפתרון וכתוצאה מכך 60 מעלות צלזיוס. בעוד הפתרון הוא להיות מחומם, להמיס שלושה משקל אחוז פוליאוריטן, או PU, ב hexafluoroisopropanol, שילוב הפתרונות לאחר פתרון PET התקרר.
לטעון מזרק 60 מיליליטר מצויד מחט 20-קצה קהה עם תערובת פולימר. השתמש במזרק ובספק כוח DC במתח גבוה מוגדרים ל-14 קילו-וולטים חיוביים על המחט, עוד ספק כוח DC במתח גבוה שנקבע למינוס שלושה קילו-וולט, קצב זרימה של חמישה מיליליטר לשעה ומרחק של 20 ס"מ מטיפ למצע כדי להפוך את הפולימר לאלקטרוספין למוט נירוסטה בקוטר של מילימטר אחד. המשך electrospinning עד עובי קיר פיגום 300 מיקרומטר מושגת.
לאחר מכן, להחליק את הפיגום מהמוט, למקם את הפיגום תחת ואקום לילה כדי להסיר כל ממס שיורית, ולעקר את הפיגום עם מינון אור אולטרה סגול של 350 millijoules לסנטימטר בריבוע במשך כ 15 דקות. בתנאים סטריליים, הסר את העור מהגפיים האחוריות של עכבר בן שישה עד שמונה שבועות, נקבה, C57-Black/6 עם מספריים עדין ומלקחיים מיקרו-אדסון, ולהשתמש מלקחיים מספר דומונט מספר חמש ודומונט מספר 5/45 מלקחיים כדי להסיר את fascia ואת הגידים. להפריד את העצמות כדי לאפשר לכל אחד מהם להיחתך בשני הקצוות, ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 25-מד כדי לשטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי המכיל 30 מיליליטר של מדיום RPMI.
כאשר כל העצמות כבר סמוקות, לסנן את מח העצם דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר את הצינור לארון biosafety. מוסיפים בעדינות את תסנובת התא המונונוקלארי המסוננת לאורך הצד של צינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פוליזוקרוז ונתרן diatrizoate מבלי לערבב את השכבות, ולהפריד את הפלזמה מתאי הדם הלבנים והאדום על ידי הפרדת שיפוע צפיפות. בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את השכבה האמצעית ברור המורכבת תאים mononuclear מח העצם, ולשטוף את תאי מונונוקלאר מח העצם ביחס של אחד לאחד PBS על ידי צנטריפוגה.
תן את גלולה בחמישה מיליליטר של PBS לשטוף השני, ואחריו התפלה ב 10 מיליליטר של מדיום RPMI טרי לספירה. לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, ולדלל את התאים לאחת פעמים 10 לשבעה תאים לכל חמישה microliters של ריכוז RPMI טרי. לפני זריעת הפיגום, חותכים את הפולימר לאורך של חמישה מילימטר לפי הצורך, ומרטיבים את הפיגום עם חמישה מיקרוליטרים של מדיום RPMI למשך חמש דקות.
בסוף הדגירה, להסיר את המדיום עודף, ולדעון את לומן פיגום עם חמישה microliters של פתרון התא מונונוקלארי מח העצם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להכניס מחט 21-מד דרך לומן של הפיגום, ולהכניס את השתל במיליליטר אחד של מדיום RPMI לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר אינדוקציה של הרדמה כללית, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל החיים המטופל, ולהחיל משחה על העיניים של החיה.
גזור את השיער באתר הניתוח מסנטר לעצם הבריח, והצב את החיה על כרית כירורגית בתווית שקע הגבית. באמצעות טכניקה אספטית, לחטא את האתר הכירורגי עם povidone-יוד רציף, 70%אתנול, povidone-יוד לנגב סדרה, ולהזיז את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח עם הראש בשעה 12. השתמש במספריים עדינים ומלקחיים מיקרו-אדסון כדי לבצע חתך קו האמצע מן עצם הבריח לעצם הלשון, ולהשתמש Dumont מספר חמש ומספר שבע מלקחיים עדינים ספוגית כותנה סטרילית כדי לנקות את fascia לפני החדרת נסיגה קוליברי שמירה עצמית לתוך החתך.
השתמש במקלות כדי לפתוח את שרירי הרצועה כדי לחשוף את הסחוס בבלוטת התריס, סחוס cricoid, קנה הנשימה, ולהפריד בבוטות את קנה הנשימה מן עצבי הגרון החוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדי הרקמה, ואחריו הפרדה היקפית של קנה הנשימה מן הוושט. באמצעות מחט 20-מד וסמן כירורגי, להכתים את החלק הראשון של קנה הנשימה. בצע חתך מתחת לטבעת הסחוס הטרצ'לית השלישית באמצעות זוג מספריים של קפיץ ואנה-טובינגן וזוג מטחנים עדין של דומונט מספר שבע כדי לכרות קטע של שלוש טבעות של קנה הנשימה.
מחזיקים את קנה הנשימה עם ממטרים מעוגלים עדין, להשתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0 כדי לאבטח את הקצה הדיסטלי של קנה הנשימה אל עצם החזה כדי ליצור tracheostomy זמני, ולהשתמש מחט 20 מד סמן כירורגי כדי להכתים את החלק הראשון של השתל. כדי להשתיל את השתל, השתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0, דומונט מספר שבע מלקחיים עדין, ומחזיק מחט כדי להכניס את התפרים הפרוקסימליים-אחוריים, הפרוקסימליים-צדדיים והפרוקסימליים-לפנים, ולהפוך את החיה ל-180 מעלות. כאשר העכבר נמצא בעמדה, לשחרר את קנה הנשימה הזמני, ולעשות חתך בצד השני חמישה מילימטרים מן החלק הראשון של השתל כדי להקל על anastomosis דיסטלי.
כדי להשלים את anastomosis דיסטלי, מניחים את התפרים באופן דומה לאנסטומוזיס הפרוקסימלי, ולמקר מחדש את תנוחת השתל ואת שרירי הרצועה. לאחר מכן, לסגור את החתך עם 9-0 תפרים ניילון סטרילי בתבנית ריצה, ולניח את החיה לבד בכלוב התאוששות להציב על כרית חימום עם ניטור עד החלמה מלאה. שבועיים לאחר ההשתלה, כמה תאי אפיתל בסיס ניתן לראות על ידי קרטין התא הבסיסי חמש ו 14 כתמים בסעיפים רקמה מהונדסים רקמה השתלת קנה דרך.
תאים בזליים מזוהים גם על פני השטח הזוהרים של השתל בשבעה ימים לאחר ההשתלה. עם ההשתלה והניתוח ההיסטולוגי, זוהתה ההטמנה של השתל כגורם התורם העיקרי בעכברים מושתלים המודגמים סימנים של מצוקה נשימתית וחנק. שים לב כי טלסקופ של השתל קנה הנשימה המקומי הוא ממצא נפוץ כתוצאה של הטכניקה הכירורגית.
כתמים עבור F4/80 חושף מקרופאגים מארחים בתוך האזור הסטנוטי של השתל בשילוב עם נוכחותם של תאי האפיתל הבסיסיים. הימנע מניפולציה של עצבי הגרון החוזרים ונשנים, ולהבטיח כי התפרים הפרוקסימליים והדיסטליים נמצאים במקום כדי לאפשר חותם אטום על anastomosis. כמו פרוטוקול זה עוסק בתאים mononuclear מח עצם נגזר עכברים סוכן ברמה biosafety אחד, חשוב ללבוש ציוד מגן אישי המתאים, כדי למנוע זיהום.
