Наши анализы могут быть использованы для проверки соединений на их влияние на функцию сперматозоидов человека. В частности, эти методы могут быть использованы для быстрого и легкого проверки большого количества соединений для их воздействия на сигнализацию кальция и акросомную реакцию в клетках спермы человека. Визуальные демонстрации этого метода упростит другим проведение подобных экспериментов в собственных лабораториях.
Начните с размещения одной 50 миллилитров трубки на один миллилитр сырой образец спермы в трубку стойку под углом 45 градусов и добавить четыре миллилитров 37 градусов по Цельсию человеческой тубали жидкости или HTF положительной среде каждой трубки. Далее, тщательно пипетка один миллилитр ликуется образца спермы на дно каждой трубки и место труб при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. В конце инкубации используйте модифицированный наконечник пипетки, удерживаемый под углом 45 градусов, чтобы аккуратно перенести как можно большую часть верхней доли подвижной сперматозоидов, содержащей положительную среду HTF, в новую пластиковую трубку объемом 15 миллилитров.
Чтобы подсчитать собранные сперматозоиды, разбавить 20 микролитр aliquot в 10, 20, 30, 50 или 90 в буфере S100 в круглой нижней два миллилитров трубки в соответствии с ожидаемой концентрацией. Вихрь разбавленных сперматозоидов в течение 10 секунд при 700 вращениях в минуту. Затем погрузите кассету SP1 в образец и полностью угнетайте белый поршень, чтобы аспирировать алицит образца в кассету.
Затем поместите кассету в лоток цитометра изображения и запустите анализ окрашенных клеток спермы ИП в соответствии с применяемым фактором разбавления. Для измерения изменений в свободной внутриклеточной концентрации кальция, мягко пипетки образца спермы вверх и вниз один раз и использовать автоматический ретранслятор пипетки для aliquot 50 микролитров флюорофора окрашенных сперматозоидов до 24 скважин одного ряда 384 микро пластины скважины. Поместите микро-пластину в считыватель пластин флуоресценции при 30 градусах по Цельсию и выберите соответствующий протокол для флюорофора.
Выберите колодец в ряду сперматозоидов и отрегулируйте выигрыш до целевого значения 20%Затем начните измерение. После 10 базовых циклов, приостановить эксперимент и извлечь ящик с микро пластины хорошо. Используя трубу из 12 каналов, быстро добавьте 25 микролитров подготовленных растворов соединений и элементов управления, представляющих интерес, в 12 дублирующих скважин в ряду и немедленно верните пластину читателю, чтобы продолжить измерение как можно быстрее.
Любые изменения флуоресценции в ответ на добавление соединений или элементов управления будут захвачены прибором. Для анализа акросомной реакции, после инкубации емкости сперматозоидов с соответствующими флуоресцентными красителями, соединениями или элементами управления, смешайте образцы с помощью пипетки и добавьте 50 микролитров каждого тестового образца в 100 микролитров иммобилизирующего раствора. Смешайте образцы снова и загрузить камеры одного слайда A2 на образец с примерно 30 микролитров образца на камеру.
Затем поместите первый загруженный слайд на лоток цитометра изображения. Выберите протокол FlexiCyte и нажмите Run. Здесь репрезентативные результаты эксперимента тестирования эффекта четырех соединений, положительный контроль прогестерона и отрицательный контроль буфера с использованием средней пропускной способности кальция сигнализации анализ, как попродемонстрировано, можно наблюдать.
На этом графике показана кривая реакции дозы прогестерона, полученная из пиковых процентных изменений внутриклеточной свободной концентрации кальция, вызванных последовательно разбавленной концентрацией прогестерона. Эти данные иллюстрируют влияние одного отрицательного или одного из двух положительных элементов управления на индукцию акросомной реакции в емкости клеток спермы человека в средней пропускной способности акросомной реакции анализа. Чтобы не пропустить пики индуцированных сигналов, крайне важно быстро добавить химические вещества в реплику скважин и немедленно продолжить измерение после этого.
Изменяя тип фторфоров и красителей, наши анализы могут быть легко изменены, чтобы ответить на различные научные вопросы. Эти анализы уже были использованы в нескольких исследованиях, чтобы проверить большие группы соединений для их воздействия на функцию спермы человека.
