Целью этих процедур является оценка целостности сперматозоидов с использованием конкретных флуоресцентных зондов в сочетании с флуоресцентной микроскопией или цитометрией потока. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области размножения, такие как прогнозирование потенциала оплодотворения и качества образца спермы. Основным преимуществом этих методов является то, что они позволяют точной оценки нескольких мембран спермы, которые, как известно, связаны с потенциалом оплодотворения спермы.
Последствия этих методов распространяются на диагностику качества эякулята, поскольку она позволяет более точную оценку плазмы спермы и акросомной мембраны целостности, а также митохондриальной мембраны потенциал. Чтобы начать эту процедуру, получить примерно от одного до шести миллилитров бычьей спермы в 15 миллилитров трубки при комнатной температуре. Добавьте шесть миллилитров буфера NKM, предварительно разогретых до 37 градусов по Цельсию, к каждому миллилитру спермы.
Центрифуга по 600 раз г в течение восьми минут. Повторите центрифугу один или два раза, пока супернатант не будет ясен. После этого, немедленно отбросить большую часть супернатанта, оставив примерно один сантиметр супернатанта над гранулами.
Тщательно наклонить трубки под углом 30 градусов в инкубаторе и ждать от 20 до 30 минут, чтобы позволить сперматозоидов плавать вверх. Используя микропипюту, аккуратно удалите оставшийся миллилитр супернатанта, который теперь содержит подвижную сперматозуа, и перенесите его в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Держите сперму на 37 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
Во-первых, подготовить все необходимые фондовые решения, изложенные в текстовом протоколе. Затем перенесите 133 микролитера подвижной сперматозои в концентрации 25 миллионов сперматозоидов на миллилитр в новую 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 17 микролитров рабочего раствора DAPI и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Центрифуга по 1000 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте в гранулы 100 микролитров буфера NKM. Далее добавьте 50 микролитров FITC-PSA, два микролитров JC-1 и три микролитров ИП. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Центрифуга по 1000 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 40 микролитров буфера NKM. Затем перенесите 10 микролитров образца на стеклянную горку.
Смазать образец и добавить крышку. После этого немедленно начните визуализировать образец с помощью микроскопии эпифторесценции с целью 40X и тройным фильтром, как указано в текстовом протоколе, используя цифровую камеру для захвата отдельного изображения для каждого фильтра. Используйте опцию слияния в программном обеспечении камеры для слияния трех изображений, полученных от фильтров, сохраняя новый файл в формате JPEG.
Откройте объединенное изображение с помощью инструмента краски и используйте опцию кисти, чтобы отметить подсчитанную сперматозуа. Далее, классифицировать сперматозоидов на основе флуоресценции, испускаемой из каждого зонда, убедившись, чтобы оценить по крайней мере 200 сперматозоидов на слайд. Все ячейки должны отображаться синим цветом daPI.
Подсчитайте мертвые клетки, которые кажутся фиолетовыми, чтобы оценить жизнеспособность. Затем используйте модели окрашивания флуоресценции для оценки состояния акросомы. Наконец, оценить митохондриальный мембранный потенциал, отличая сперматозоидов с высоким митохондриальным мембранным потенциалом, которые демонстрируют окрашенные в красный цвет средний от сперматозоидов с низким потенциалом митохондриальной мембраны, которые демонстрируют зелено-окрашенные середине.
Подсчитайте красные и зеленые средние части отдельно и вычислите их соотношение. Чтобы начать оценку целостности плазменной мембраны, возьмите нужное количество скважин из набора жизнеспособности и концентрации. Перенесите скважины на рабочую базу и накройте их гибкой крышкой, чтобы защитить их от света.
Добавьте к каждой колодец 199 микролитров буферного раствора для цитометрии. Затем добавьте один микролитр однородной спермы при концентрации 57 миллионов клеток на миллилитр к каждой колодец и гомогенизируйте путем пипетки. Накройте пластину крышкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
После этого запустите образец через цитометр потока с помощью параметра жизнеспособности. Чтобы начать оценку потенциала митохондриальной мембраны, вывихив нужное количество скважин из набора митохондриальной активности. Перенесите их на рабочую базу.
Добавьте 10 микролитров абсолютного этанола к каждой хорошо и использовать пипетку, чтобы повторно порошок присутствует в колодец. Добавьте 190 микролитров PBS на колодец и гомогенизируйте с помощью пипетки. Добавьте 0,75 микролитров однородной спермы в концентрации 57 миллионов клеток на миллилитр к каждой колодец и гомогенизируете с помощью пипетки.
Накройте пластину крышкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого запустите образец через цитометр потока с помощью параметра митохондриальной активности. Чтобы начать оценку целостности акросомальной мембраны, вынюхив нужное количество скважин из набора жизнеспособности и акросомной целостности.
Перенесите скважины на рабочую базу и накройте их гибкой крышкой, чтобы защитить их от света. Добавьте к каждой колодец 200 микролитров буферного раствора для цитометрии. Затем добавьте 0,7 микролитров однородной спермы с концентрацией 57 миллионов клеток на миллилитр к каждой колодец и гомогенизируете с помощью пипетки.
Накройте пластину крышкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут. После этого запустите образец через цитометр потока, используя настройки проницательности. В этом исследовании качество спермы оценивается с использованием различных методов, одна из которых оценивается сперматозоидов мембран с помощью флюорометрических зондов.
Можно оценить различия в качестве образца спермы с точки зрения целостности мембраны. Например, эякулята быка номер семь был относительно низкий процент мертвых клеток, низкая доля спермы с псевдо-реакции акросомы, и более высокий митохондриальный мембранный потенциал по сравнению с эякулятом быка номер один. Образцы затем оцениваются на жизнеспособность и митохондриальную активность.
Гистограммы для этих репрезентативных примеров представляют собой неунгуемые сперматозоиды и мусор и закрытое сперматозоиды. Эти гистограммы также представляют собой жизнеспособные и мертвые клетки и распределение сперматозоидов на поляризованную и деполяризованную митохондриальную мембрану. Акросома целостности затем оценивается с готовым к использованию комплекта и читать с потоком цитометрии, разделяя область на три маркера областях, которые представляют собой незначительные низкие флуоресцентные клетки с нетронутыми нетронутые акросомы, низкие флуоресцентные клетки с остаточным окрашенных частью акросомы, и очень флуоресцирования клеток с нарушенной акросомы.
При попытке этих процедур, важно, чтобы убедиться, что подготовить должным образом первоначальный образец спермы. Эти методы могут дать представление об оценке качества спермы и могут быть применены к различным организмам, таким как бык, птица и человек. Сравнение этих двух методов, четырехкратное окрашивание и цитометрия потока не показали существенных различий в жизнеспособности, митохондриальном мембранном потенциале и акросомной целостности, что свидетельствует о том, что эти два метода дали соответствующие результаты.
