Nuestros ensayos se pueden utilizar para probar compuestos para sus efectos sobre la función de los espermatozoides humanos. Específicamente, estos métodos se pueden utilizar para examinar rápida y fácilmente un gran número de compuestos para sus efectos sobre la señalización de calcio y la reacción acrosoma en las células espermáticas humanas. Las demostraciones visuales de este método facilitarán a otros la configuración de experimentos similares en sus propios laboratorios.
Comience colocando un tubo de 50 mililitros por mililitro de muestra de semen crudo en un portatubos en un ángulo de 45 grados y agregando cuatro mililitros de 37 grados Celsius Human Tubal Fluid o HTF positivo medio a cada tubo. A continuación, pipetee cuidadosamente un mililitro de muestra de semen licuado en la parte inferior de cada tubo y coloque los tubos a 37 grados centígrados durante una hora. Al final de la incubación, utilice una punta de pipeta modificada sostenida en un ángulo de 45 grados para transferir suavemente la mayor parte de la fracción superior de la célula de esperma móvil que contiene el medio positivo HTF como sea posible en un nuevo tubo de plástico de 15 mililitros.
Para contar las células espermáticas recogidas, diluya una alícuota de 20 microlitios a un factor de 10, 20, 30, 50 o 90 en tampón S100 en un tubo redondo inferior de dos mililitros de acuerdo con la concentración esperada. Vórtice de las células espermáticas diluidas durante 10 segundos a 700 rotaciones por minuto. A continuación, sumerja un cassette SP1 en la muestra y presione completamente el émbolo blanco para aspirar una alícuota de la muestra en el cassette.
A continuación, coloque el cassette en la bandeja del citometro de imagen y ejecute el ensayo de células espermáticas humanas manchadas de PI de acuerdo con el factor de dilución aplicado. Para medir los cambios en la concentración de calcio intracelular libre, pipetee suavemente la muestra de espermatozoides una vez y utilice una pipeta repetidor automática para alícuota de 50 microlitros de espermatozoides manchados de fluoróforo a 24 pozos de una fila de una placa de micro pozo 384. Coloque la placa de micro pozo en el lector de placas de fluorescencia a 30 grados Celsius y seleccione el protocolo adecuado para el fluoróforo.
Seleccione un pozo en la fila de células espermáticas y ajuste la ganancia a un valor objetivo de 20%Luego inicie la medición. Después de 10 ciclos de línea base, detenga el experimento y expulse el cajón con la placa del micro pozo. Usando una pipeta de 12 canales, agregue rápidamente 25 microlitros de las soluciones preparadas de compuestos y controles de interés en los 12 pozos duplicados en la fila y devuelva inmediatamente la placa al lector para continuar la medición lo más rápido posible.
Cualquier cambio en la fluorescencia en respuesta a la adición de los compuestos o controles será capturado por el instrumento. Para el análisis de reacción acrosoma, después de incubar las células espermáticas capacitadas con los tintes fluorescentes, compuestos o controles apropiados, mezcle las muestras pipeteando y agregue 50 microlitros de cada muestra de ensayo a 100 microlitros de solución inmovilizadora. Mezcle las muestras de nuevo y cargue las cámaras de una diapositiva A2 por muestra con aproximadamente 30 microlitros de muestra por cámara.
A continuación, coloque la primera diapositiva cargada en la bandeja del citometro de imagen. Seleccione el protocolo FlexiCyte y pulse Ejecutar. Aquí se pueden observar los resultados representativos de un experimento que prueba el efecto de cuatro compuestos, un control positivo de la progesterona y un control de búfer negativo utilizando el ensayo de señalización de calcio de rendimiento medio, tal como se ha demostrado.
En este gráfico, se muestra una curva de respuesta a la dosis de progesterona derivada de los cambios porcentuales máximos en la concentración de calcio libre intracelular inducida por la concentración diluida en serie de progesterona. Estos datos ilustran los efectos de uno negativo o uno de los dos controles positivos sobre la inducción de una reacción acrósoma en células espermatozoides humanas capacitadas en un ensayo de reacción acrosoma de rendimiento medio. Para evitar perder los picos de las señales inducidas, es fundamental añadir los productos químicos rápidamente a los pozos de réplica y continuar inmediatamente la medición a partir de entonces.
Al cambiar el tipo de fluoróforos y tintes, nuestros ensayos se pueden modificar fácilmente para responder a diferentes preguntas científicas. Estos ensayos ya se han utilizado en varios estudios para probar grandes grupos de compuestos para sus efectos sobre la función de los espermatozoides humanos.
