Этот метод обеспечивает быстрый и надежный диагностический инструмент для идентификации Bemisia tabaci, инвазивных насекомых-вредителей, влияющих на производство овощей и декоративных культур во многих странах мира. Благодаря своей простоте, метод может быть выполнен на месте непосредственно в пунктах въезда для растительной импортной продукции, таких как гавани и аэропорты, и тем самым имеет потенциал для сокращения разгона Bemisia tabaci вдоль торговых сетей. Для начала используйте ножницы, чтобы разрезать восьмитрубную полоску LAMP на две четырехтрубные полоски LAMP.
Затем отметь трубки по схеме, изложенной в рисунке одного из текстовых протоколов. После этого, подготовить достаточно B.tabaci LAMP реакции мастер смесь для 80 реакций. Затем раздайте 22,5 микролитров мастер-микса в каждую из трубок четырехтрубных полос LAMP.
Импульсная центрифуга, и положить их на лед. Быстрый вихрь и импульсная центрифуга B.tabaci LAMP PAC. Затем добавьте 2,5 микролитров в трубку с маркировкой PAC в каждой из четырехтрубных полос LAMP.
Затем закройте крышки и храните готовые к использованию комплекты B.tabaci LAMP при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для начала извлечения ДНК используйте стерильные зубочистки для переноса образцов насекомых в 0,5-миллилитровые микроцентрифуги с 30 микролитров раствора для извлечения ДНК. Затем инкубировать образцы в течение пяти минут при 95 градусах по Цельсию в ThermoMixer установить до 300 об / мин.
Кратко вихрь и пульс центрифуги образцов. Оттепель один из готовых к использованию комплектов B.tabaci LAMP. Затем, вихрь комплект быстро, и пульс центрифуги его.
Добавьте 2,5 микролитров экстракта образцов ДНК в трубки S-one и S-two. Затем добавьте 2,5 микролитров чистого щелочного раствора для извлечения ДНК в трубку NAC. После вихревого и импульсного центрифугирования комплекта вставьте комплект в аналитическое устройство LAMP и проведем изотермальный анализ усиления ДНК при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут.
В том же запуске, выполнить анализ температуры плавления продуктов усиления ДНК, сначала нагревая комплект до 98 градусов по Цельсию и охлаждения его до 75 градусов по Цельсию. Проверка считывания LAMP с помощью автоматизированного приложения проверки LAMP. Во-первых, определите целевой вид и количество проверенных образцов, прежде чем нажать кнопку Generate Report.
Наконец, перенесите считывание в соответствующие области ввода приложения проверки. Сразу же после ввода данных будет отображаться результат проверки. В этом протоколе образцы насекомых B.tabaci, перехваченные в ходе регулярного швейцарского процесса контроля импорта, были проанализированы с помощью анализа LAMP.
Из 80 проанализированных образцов 75 образцов были правильно идентифицированы как истинные положительные стороны, а два образца были правильно идентифицированы как истинные негативы. Три образца, однако, были ложными негативами и были неправильно идентифицированы как не B.tabaci. Подмножество анализов было проведено на месте инспекторами по охране здоровья растений в аэропорту Цюриха.
В репрезентативных результатах образцы один и два были правильно идентифицированы как B.tabaci с помощью усиления ДНК примерно через 30 минут при ожидаемой температуре 82 градусов по Цельсию. После своего развития, этот метод проложил путь для быстрой и простой в работе на месте идентификации Bemisia табачи. Протокол разработан таким образом, что он может быть выполнен инспекторами по охране здоровья растений с ограниченной лабораторной подготовкой.
После успешной проверки метода на месте в швейцарском пункте въезда для растительной импортной продукции, метод может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам растений, но и, при необходимости, к другим человеческим или ветеринарным патогенам.
