Мы представляем фундаментальные, но весьма востребованные массы для массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований с использованием серьезных масс вредителей Тортрикса, для изучения их биологии. До сих пор структура яиц насекомых препятствовала дальнейшему анализу. Примечательно, что мы позволили изучить тонкие, мягкие и хрупкие яйцеклетки, покрытые материнской секрецией.
Ожидается, что существуют простые методы, которые будут применимы для дальнейших исследований тортрикса, пробования других насекомых и других таксонов. Начните с того, что поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 миллилитров с листом парафиновой бумаги, чтобы установить линию Matra. Нарежьте примерно 60 граммов искусственных диет с помощью терки для массового выращивания.
Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер. Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами. Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковую коробку для спаривания при температуре 25 градусов цельсия.
Собирайте яйца каждые пять-семь дней и повторяйте массовые этапы выращивания для каждого поколения. Замочите яичную массу в 1000 микролитрах 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 минут или в 1000 микролитрах пяти молярных водных растворов гидроксида калия в течение 30 минут для отделения яиц. Вымойте отделенные яйца в 1000 микролитров PBSt.
Замочите яйца в массе объемной смеси 500 микролитров 100%гептана и 500 микролитров 4%-ного раствора параформальдегида PBSt. Перемешивайте в течение 10 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту с помощью вихревого смесителя. Замочите яйца в смеси из 500 микролитров 100% гептана и 500 микролитров 100% метанола.
Перемешивать в течение 10 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Дважды вымойте яйца 1000 микролитрами 100% метанола и храните их при четырех градусах Цельсия в 100% метаноле. Замочите яйца последовательно в 99% 70% и 50% этаноле и PBSt в течение пяти минут каждый для гидрофилизации.
Вымойте яйца PBSt. Погрузите яйца в один микрограмм на миллилитр раствора DAPI в течение пяти минут, а затем дважды вымойте яйца PBS. Замочите яйца в 20 микролитрах 1,25% молочного, уксусного или CN раствора, чтобы визуализировать гетерохроматин до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет.
Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку, затем заключите их анти-выцветающим реагентом и покровным стеклом. Экстракт личинок Феррата, Амонамагнетама и Adoxophyes honmai из яичных масс с помощью щипцов. Рассекните личинок на стеклянной горке.
Зафиксируйте ткани смесью от одного до трех 99,7% аскетической кислоты в 100% метаноле в течение пяти минут. Окрашивайте те, которые имеют вес 1,25% по весу молочным, аскетическим или CN раствором до тех пор, пока ядра не будут окрашены. Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием гетерохроматина у самок или отсутствием у самцов под микроскопом.
Чтобы извлечь ДНК и РНК из личинок феррата, определяемых полом, объедините 12 личинок феррата мужского или женского пола и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК в одну трубку размером 1,5 миллилитра. Этапы фиксации, пермеабилизации и окрашивания позволяют визуализировать ядра с помощью раствора DAPI. Молочное, аскетическое или CN окрашивание с использованием рассеченных личинок феррата показало, что самки проявляют гетерохроматин в виде точки, но у самцов отсутствует гетерохроматин.
Модифицированные протоколы, использующие спиновую колонку, улучшили качество РНК, производящей от 900 до 1500 нанограммов продукта с соотношением 260 к 200 от 1,9 до 2,1 и соотношением 260 к 280 от 1,9 до 2,3. Коэффициент концентрации РНК для модифицированного протокола был ниже 1,2, что соответствовало требованиям качества для секвенирования следующего поколения. Неповрежденность РНК, извлеченной из половых определяемых личинок феррата с помощью модифицированного протокола, была подтверждена с помощью микрочипового электрофореза.
Было подтверждено, что подготовленные библиотеки дают высокую оценку Q 30. Наше послание вносит свой вклад в фундаментальные исследования насекомых и инструменты для борьбы с вредителями. Кроме того, наши протоколы могут быть использованы для оценки эффективных химических пестицидов или межклеточных микробов во время эмбриогенеза.
