Этот протокол предоставляет метод для выявления РНК-взаимодействователей РНК связывающего белка PKR в геноме всей образом. Это помогает нам лучше понять пост-транскрипционные регуляции экспрессии генов РНК связывающий белок. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует эффективное скрещивание формальдегида, чтобы исправить RNase связаны с РНК-связывающих белков и обогатить их с помощью иммунопреципиентации.
Активированный PKR наблюдается у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона и Болезнь Альцгеймера. Выявление PKR-взаимодействующих двухместных RNase поможет нам лучше понять патогенез этих дегенеративных заболеваний. Этот метод может быть использован для изучения РНК-взаимодействователей любых РНК-связывающих белков.
В частности, мы считаем, что этот метод полезен для изучения белков, которые распознают структурированные RNase, такие как двуединый RNase. Проверьте однородность арестованного цикла образца перед сбором клеток. Кроме того, крайне важно оптимизировать эффективность иммунопреципиентации, используя наилучшие доступные антитела.
Для начала семя 750 000 или один миллион клеток HeLa для S-или M-фазы арестованных образцов, соответственно. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение 24 часов. Лечить клетки с двухмилимоляным тимидином, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 18 часов.
Вымойте клетки два раза с PBS. Затем добавьте свежие средства массовой информации и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение девяти часов. Для S-фазы арестованных клеток, лечить клетки с двухмимолярного тимидин.
Для M-фазы арестованных клеток, лечить клетки с 100 нанограмм на миллилитр нокодазола. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 часов. Для S-фазы образца, собирать клетки с сотовым скребок, и передать в 15-миллилитровую коническую трубку.
Для образца M-фазы коснитесь стороны блюда клеточной культуры, чтобы отделить М-фазы арестованных клеток, и передать их в 15-миллилитровую коническую трубку. Далее центрифуга клетки при температуре 380 г при комнатной температуре в течение трех минут. Удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток с одним миллилитр холодного PBS.
Передача клеток в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Центрифугать клетки при 10 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд, и удалить супернатанты полностью. Для выполнения перекрестного скрещивания формальдегида сначала добавьте 750 микролитров 0,1%параформальдегида в клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы исправить клетки.
Затем добавьте 250 микролитров одномолярного глицина и инкубировать при комнатной температуре еще 10 минут, чтобы утолить реакцию. Центрифуга клеток при 10 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд. Удалите супернатанты полностью.
Далее, resuspend с одним миллилитров PBS. Центрифуга клетки при 10 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд, и удалить супернатант. Resuspend с 400 микролитров буфера лиза fCLIP дополнен 0,2 тома процентов ингибитор протеазы и два объема процентов RNase ингибитор.
Инкубировать на льду в течение 10 минут, и sonicate с помощью ультразвукового. Затем добавьте 11 микролитров хлорида натрия из пяти моляров, чтобы отрегулировать концентрацию хлорида натрия до 150 миллимоляров, и вихрь кратко. Затем центрифуга при 21, 130 г при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.
Перенесите супернатанты в предварительно охлажденную микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитром. Для выполнения иммунопреципиентации сначала добавьте 20 микролитров белка А в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Затем вымойте бисер 400 микролитров буфера лиза fCLIP.
Центрифуга бисера при 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Затем удалите супернатант, добавьте 400 микролитров буфера лиза fCLIP тщательно и аккуратно повторно наполните бисер, инвертировать три-четыре раза. Повторите шаг мытья три раза.
После окончательной стирки полностью удалите супернатанты. Перепрофиль бисера в 300 микролитров буфера лиза fCLIP. Добавьте 8,3 микролитров хлорида натрия из пяти моляров для регулировки концентрации хлорида натрия до 150 миллимоляров.
Добавьте 10 микролитров рнк-активированного антитела протеина киназы и инкубировать на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Затем центрифуга бисера при 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Удалите супернатант, добавьте 400 микролитров буфера для мытья FCLIP и аккуратно повторно наполните бисер, инвертировать три-четыре раза.
Повторите шаг мытья два раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатанты. Затем добавьте 300 микролитров лизата и инкубировать при четырех градусах цельсия на ротаторе в течение трех часов.
Затем центрифуга бисера при 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Удалите супернатант, добавьте 400 микролитров буфера для мытья FCLIP и аккуратно повторно наполните бисер, инвертировать три-четыре раза. Повторите шаг мытья три раза.
После окончательной стирки, удалить супернатант полностью. Далее добавьте 300 микролитров буфера elution fCLIP. Инкубировать в ThermoMixer при 25 градусах по Цельсию в течение трех часов, чтобы элют белка киназы РНК активируется из бисера.
Центрифуга при температуре 1000 г при комнатной температуре и перенос супернатантов в чистую силиконовую трубку. Наконец, добавьте 300 микролитров протеиназы K и инкубировать на ночь при 65 градусах по Цельсию. Эффективность ареста клеточного цикла клеток HeLa на этапе S или M была изучена с помощью FACS.
D7F7 антитела показали превосходную способность к иммуно осадки белка киназы РНК активирована. Западный анализ помарки PKR immuno precipitated или полного ликата HeLa показал только одну сильную полосу, соответствующую размеру PKR, что указывает на то, что антитела D7F7 весьма специфичны в признании PKR. Использование различных антител PKR с различной эффективностью иммуно осадков привело к различному классовому распределению секвенирования карт.
Снижение радиоизотопного сигнала для PKR со-иммунопринципиатированных RNase наблюдалось при успешном удалении рРНК. PKR совместно иммунопрофилированных РНК образца, показали сильное обогащение митохондриальных RNase по сравнению с отрицательным контролем. Strand конкретные обратной транскрипции был использован для различения тяжелых и легких нити митохондриальной RNase, которые были совместно иммунопрофилированы с PKR для S или M фазы арестованных клеток.
Наиболее важным шагом в подготовке образца ареста клеточного цикла, где вы должны мыть клетки два раза с PBS и где вы должны собирать только клетки пастели для однородности или будет нарушена образца. Для этически процесса наиболее важными шагами являются перекрестные линии формальдегида и количество. После этой процедуры eluted RNAs можно проанализировать используя северное blotting, пЦР qRT или секвенирование высокой пропускной способности.
Эти эксперименты могут определить тип и относительное количество RNase связано с PKR. Этот метод может быть применен для изучения и выявления РНК-взаимодействователей РНК связывающих белков, которые укрепят наше понимание пост транскриптной регуляции экспрессии генов, опосредовано РНК связывающих белков. Формальдегид опасен, поэтому фиксация, раствор и начальный буфер стирки должны быть обработаны с осторожностью.
