Чай является одним из самых популярных напитков во всем мире. Пестициды иногда используются для защиты чайных растений от вредителей. Некоторые системные пестициды могут быть сделаны для этого ферментами в чайном дереве.
А затем интегрируется через окисление, гидролиз, или снижение реакции. Культуры подвески растительных клеток могут быть использованы в качестве легкого для изучения поведения метаболизма растений пестицидов. Этот метод имеет ряд преимуществ.
Во-первых, его можно эксплуатировать в условиях свободных микроорганизмов, таким образом, избегая вмешательства деградации пестицидов, вызываемой микробами. Во-вторых, он может обеспечить постоянный материал для нас в любое время. Наконец, он также может быть легко использован для сравнения теорий поведения пестицидов в одном эксперименте.
В этом исследовании мы устанавливаем культуры подвески чайных клеток из переменных цветов чайных листьев. Оптимальный статус культур клеточных суспензий затем был использован для сравнения поведения рассеивания шести пестицидов. Этот эксперимент будет проводиться Цзяо Вейтин и Ге Гоцин.
Это наш чай стерильных растений, который работает в качестве источника explant. Вырезать вдоль среднего крыла стерильного листа с помощью ножниц. А потом, подраздеть каждую половину на мелкие кусочки примерно в 0,3 раза 0,3 сантиметра в чашке Петри.
Поместите стерильные экспланты на MS визуальную среду, содержащую 2, 4-D и KT. Шесть эксплантов можно поместить в 300-миллилитровую колбу. Культура листьев explants при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию в темноте. Через 28 дней выберите первое поколение индуцированного каллуса, а затем перенесите на свежую колбу.
Приобрети свободный и переменный каллус после трех-четырех субкультур. Разрежьте большие, переменные и свободные мозоли из твердой среды на мелкие кусочки с помощью стерильного хирургического лезвия в стерильных условиях. У нас около трех граммов маленьких кусочков каллуса.
Поместите каллус в B5, содержащий 2, 4-D и КТ. Культура жидкой клеточной подвески при постоянной температуре в трясущимся инкубаторе в темноте. После семи-десяти дней культивирования, удалить культурную колбу, и оставить их стоять в течение нескольких минут. Возьмите супернатант, как осадок здесь заставит культуру к свежей среде.
Удалите осажденные большие мозоли. Получите окончательную ухоженную культуру подвески клеток после четырех-трех циклов субкультуры по 28 дней каждый. Держите образец живых клеток на сто градусов по Цельсию в течение десяти минут в качестве контрольной ячейки до жизнеспособности окрашивания.
Центрифуга все культуры подвески клеток в течение восьми минут на 6000 Г.Удалить супернатант перед приостановкой клеток в 5 миллилитров буфера PBS и встряхнуть его в течение одной минуты вручную. Добавьте 2,5 миллилитров раствора ТТК и пожмите вручную снова. Инкубировать смесь в течение одного часа в стоячем инкубаторе при 13 градусах по Цельсию.
Добавьте алицит из четырехсот микролитров с целью стерилизации стокового раствора всех неоникотиноидов тиаметоксама, ацетимоприда, имидаклоприда и имидепроксазы. Все к органической первой фазе. Диметоат и ометоат в культурах клеточной суспензии соответственно.
Культурные образцы клеточных суспензий с инсектицидами при постоянной температуре и скорости встряхивания инкубатора. Возьмите образцы в разные дни. Чтобы проверить образец, содержащий неоникотиноид, удалите 1 миллилитр алицит однородной клеточной культуры.
Поместите его в 1,5 миллилитровую пластиковую центрифугу трубку, и центрифуга его на 4000 Г в течение двух минут. Перейдите супернатант через мембрану фильтра 0,22 микрометра перед анализом HPLC-UV и UPLC ЗТОФ. Чтобы протестировать образец, продолжайте на органическом первом этапе.
Удалите 500 микролитр aliquot клеточной культуры и поместите в 35 миллилитровую центрифугу трубки или 1,5 миллилитров пластиковой центрифуги трубки. Добавьте 0,1 грамма хлорида натрия и пять миллилитров экстракт растворителя в 35 миллилитровую центрифугу из 500 образцов микролитра. Вихрь смеси в течение одной минуты.
А потом дать им отдохнуть 10 минут. Возьмите 2,5 миллилитров супернатанта в 10 миллилитров стеклянную трубку и испариться до почти сухости с помощью испарителя азота при 14 градусах по Цельсию. Растворите остаток одним миллилитровый ацетон.
Vortex в течение одной минуты, передать его через 0,22 микрометровой фильтровальной мембраны до анализа GC-FPD. Положите пять растений в четыре литра пластиковых горшков в течение пятнадцати дней. Добавьте ноль микрограмма на миллилитр или 100 микрограмм на миллилитр тиаметоксама или диметоакса в пластиковые горшки, соответственно.
Подготовь нетронутый образец растения по предыдущему методу, за исключением предварительной замачивания, а затем проанализируйте с помощью масс-спектрометрии Orbitrap. Используйте HPLCUV для обнаружения содержания и метаболических продуктов тиаметоксама и ацетимоприда на длинах волн 254 нанометров, а также Имидаклоприда и Имидепроксазы на 270 нанометров. Обнаружить содержание диметоата и ометоата с помощью GC-FPD с помощью трубчатого столбца.
Обнаружить метаболиты инсектицидов в клеточной культуре с помощью UPRC ЗТОФ с помощью колонки Carbon-18. Обнаружить метаболиты инсектицидов в экстракте испытательного завода с помощью масс-спектрометрии UPLC Orbitrap. Каллус одного стерильного растительного растения имеет более низкое загрязнение подрумянивания, но более высокую индукцию, что каллуса из взял чайные листья.
Каллус, полученный из стерильных листьев, всегда был ярко-желтоватым, в то время как каллус, полученный из выбранных листьев, был белым с коричневыми пятнами. Когда концентрация КТ была 0,1 миллиграмма на литр, каллус был желтоватым по цвету и рыхлым по текстуре. Темпы роста каллуса были самыми высокими, до 61,5%, когда концентрация 2, 4-D была один миллиграмм на литр с концентрацией КТ составил 0,5 миллиграмма на литр.
Данные о росте каллуса были лучшими, а темпы роста каллуса были самыми высокими и достигли 46,9%Поэтому лучшее сочетание растительного домохищенного составило один миллиграмм на литр 2, 4-D и 0,1 миллиграмма на литр КТ для роста чайного каллуса. Каллус полностью покрыл листья четвертой субкультурой, и когда цикл субкультуры составил 28 дней. Каллус вырос энергично с желтоватым цветом и свободной текстурой и без подрумянивания.
После сравнения валовых данных каллуса и цвета клеточной подвески, жидкое средство B5 было больше подходит для культуры подвески клеток. Значение OD культуры подвески клеток использовалось для представления количества роста клеток. В течение 75 дней культивирования соотношение 15 граммов на 40 миллилитров имело значение ОД значительно выше, чем у двух других соотношений.
Жизнеспособность клеток в рамках культуры подвески чайных клеток была проверена окрашивание ТТК. Бесцветное соединение ТТК может быть преобразовано в красный formadin дегидрогеназы в митохондриях живых клеток, но цвет не может быть изменен в мертвых клетках. И это весь процесс создания культуры подвески чайных клеток.
Это первое сравнительное исследование метаболизма различных пестицидов в чае с использованием техники культуры подвески клеток. Было выявлено несколько метаболитов пестицидов, и некоторые из них были дополнительно исследованы в хе-растениях. Этот новый метод может служить моделью для метаболических исследований пестицидов в чае или других растениях.
