Этот протокол позволяет нам контролировать эндогенные митофагийные комплексы в тканях человека, такие как бета-клетки, облегчая исследования митофагии в ключевых переводно-соответствующих тканях. Одним из преимуществ этого метода является его способность визуализировать важные митофагийные комплексы in vivo в тканях с редкой доступностью или небольшими номерами выборки. После изоляции в соответствии со стандартными протоколами, культура от четырех до шести раз от 10 до третьего человека островков эквиваленты в 10 миллилитров полной среды островка поджелудочной железы, по крайней мере один день при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день используйте световой микроскоп для вскрытия при трехкратных увеличении, чтобы подсчитать отдельные человеческие островки в культуре. Выберите 40 островков для лечения или состояние интереса в 1,5 миллилитровые трубки островка среды. Осадок островков центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр PBS дополняется 50 микромолярной PR619.
Инвертировать трубку и собирать островки центрифугации для второй стирки в свежем PBS плюс ингибитор deubiquitinase. После второй центрифугации, разобщить островки в одиночные клетки с 125 микролитров 0,25%трипсина плюс ингибитор в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию с периодической нежной пипетки. В конце инкубации, арест реакции с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию нагревается островок поджелудочной железы среды дополняется PR619.
Соберите островки путем центрифугации для двух моет в свежем PBS плюс ингибитор на стирку. После второй стирки, resuspend диссоциированных островков в 150 микролитров свежего ингибитора PBS плюс. Для присоединения и фиксации отдельных островков, цитоскопии клеточного раствора на матовой заряженный микроскоп слайды и наброски клеточной области с гидрофобной ручкой.
Затем исправить окружающие клетки с 4%paraformaldehyde и PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Для иммуногистохимического анализа образцов островка, мыть клетки с двумя пятиминутными моет в PBS при комнатной температуре, а затем неспецифические связывания блокировки с 10%осла сыворотки и PBS плюс 0,3% моющего средства в течение одного часа при комнатной температуре. В конце блокирования инкубации, coincubate клетки с первичными антителами мыши против убиквитина конкретных пептидаза 8, первичные антитела кролика против неурегулиновых рецепторов деградации белка-1, и маркер, специфический для бета-идентификации клеток, которые не были подняты в мыши или кролика, чтобы не вмешиваться в близость перевязки сигнал анализа ночь на четыре градуса Цельсия.
На следующее утро, мыть образцы с двумя пятиминутные моет в PBS на рокер. Добавьте анти-коза Cy5 вторичное антитело к свежеприготовленной близости перевязки анализа раствора. После второй стирки, этикетка каждого образца островка с 20 микролитров раствора зонда и восстановить слайды с пластиковой пленкой для одного часа инкубации при 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, мыть клетки с двумя пятиминутными моет в буфере на рокер следуют инкубации с 20 микролитров свежеприготовленного раствора перевязки дополняется 0,25 единиц на микролитер лигазы на слайд для 30-минутной инкубации при 37 градусов по Цельсию. В конце перевязки, мыть клетки два раза с буфером В течение двух минут за стирку. Обложка каждого образца с 20 микролитров усиления решений, дополненных полимеразы для 100-120-минутной инкубации при 37 градусов по Цельсию.
Чтобы подготовить клетки к визуализации, мыть образцы два раза в свежем буфере А в течение 10 минут за стирку на рокере с последующим одной стиркой в буфере B в 0,1 раза в течение двух минут на рокере. После последней стирки, смонтировать слайды с каплей монтажа среды, содержащей DAPI и тщательно место coverslip над каждым образцом с помощью скальпеля, чтобы выжимать любые пузыри. Затем запечатать крышки с четким лаком для ногтей по краям.
Чтобы издать образцы, поместите слайд на сцену микроскопа, способного захватить несколько фокусных плоскостей, и выберите увеличение в 100 раз. Установите высоту стека до примерно 0,45 микрометра и соответствующие параметры пятна, счетчики и параметры живого сигнала клетки. Получить по крайней мере девять различных фокусных изображений плоскости.
Чтобы свести к минимуму фоновые сигналы изображения флуоресценции и рассеянный свет, обработайте изображения с помощью двухмерного алгоритма деконволюции ближайшего соседа с помощью стандартного программного обеспечения для обработки изображений по выбору. Для количественной оценки взаимодействия перевязки близости, откройте ImageJ и откройте изображение анализа перевязки близости. Начиная с первого резко в фокусе изображения, нажмите изображение и выберите Настроить и порог.
Отрегулируйте порог, чтобы удалить весь неспецифический сигнал анализа перевязки близости и обратите внимание на регулировку порога, чтобы попытаться сохранить сигнал последовательным на протяжении всего анализа. Нажмите процесс и выберите двоичный и сделать двоичный. Подтвердите, что размер установлен с нуля до бесконечности, Циркулярность устанавливается на ноль к одному, Показать устанавливается для очертания и проверить результаты отображения и очистить коробки результатов.
Обратите внимание на количество частиц, анализируемых в электронной таблице, обозначающих образец и положение в стеке. Затем нажмите Анализ и анализ частиц для измерения частиц. Когда все в фокусе стеки для образца были проанализированы, отправьте общее количество частиц для выборки в электронной таблице для количественной оценки общего числа взаимодействий.
Антитела, используемые в анализе близости, специфичны для лигандов и не демонстрируют никакого перекрытия. Как было отмечено, протокол дисперсии является высокоэффективным при получении одиночных клеток в области микроскопа зрения для анализа вниз по течению и бета-клеток окрашивания сохраняется после близости перевязки анализа окрашивания в первичных человеческих островков. Используя продемонстрированые методы, можно определить, что взаимодействие белка деградации рецепторов нейрегулина-1 и ubiquitin-специфической пептидазы 8 снижается после 48-часового воздействия пальмитата, подчеркивая целесообразность этого анализа для оценки ключевых эндогенных факторов митофагии после диабетогенных стимулов.
Эффективная и мягкая рассеивание человеческих островков имеет важное значение для обеспечения количественной оценки правильной популяции клеток ниже по течению. НОАК позволяет проводить оценку важных митофагийных комплексов в образцах островка человека, что позволяет проводить анализ митофагии и биологически важных образцов пациентов, перемещая области исследований диабета вперед.
