Общей целью этого метода является оценка влияния манипуляций экспрессии генов на корковой нейрональной архитектуры in vivo. Нашим первым ключевым преимуществом этой процедуры по сравнению с теми, которые основаны на нейтральной электропорации, является тонкий контроль уровней экспрессии генов. В частности, этот интегрированный трубопровод позволяет in vivo оценки дефекта, возвысились небольшие изменения в экспрессии генов на контроль нейрональной цитоархитектуры.
Кроме того, парная структура трансплантационной проверки позволяет значительно сократить численность животных, необходимых для получения статистически значимых результатов. Техника использует пул прекурсоров, происходящий из трансгенных эмбрионов Tau EGFP. Этот пул подразделяется на два подфонда, которые также заражены двумя лентивирусными смесями.
Чтобы получить зеленый тестовый пул и желтый пул управления, который будет совместно вводиться. После двух дней расширения in vitro, в результате нейросферы разобщены, смешанные один к одному, и вводят с капилляром в желудочковом пространстве мыши. Десять дней спустя, иммунофлуоресценция на корональных секциях выполняется, чтобы позволить сравнение между тестом и контроля нейронов.
Наконец, иммунолентированные секции изображены и скелетизированы для окончательной оценки морфометрических параметров. Перед пересадкой in vivo подготовьтесь к зеленому бассейну-предшественнику. Эмбрионы E12.5, собранные из беременной плотины, ранее спариваой к основателю Tau EGFP, устанавливаются в отдельных скважинах многоясной пластины в растворе PBS.
Генотип их быстро при визуальном осмотре под синей лампой. Отмежевать вскрытые зеленые кортисы к одиночным клеткам. Повторно приостанавливайте ячейки в пролиферативной среде и подразделивайте их на два одинаково размера подбайсов.
Заразить каждый суб-бассейн с выделенной лентивирусной смеси. Каждая смесь содержит красную этикетку вируса или черный вирус контроля. А также вирусы для трансгена Tet-Off или выражения контроля, соответственно.
Каждый лентивирус должен вводиться при множественности инфекции 8. Плита инфицированных клеток в пролиферативной среде с 2 микрограммами на миллилитр доксициклина. Перенесите клетки в инкубатор и оставьте их на 2 дня при 37 градусах.
Через 2 дня два суб-пула должны появиться в качестве суспензий малых нейросфер. Однородно выражая красный флуоресцентный белок, или нет. После проектирования прекурсоров, установить оценить массив для трансплантации в P0 белых щенков лаборатории.
Используйте борозиликатные стеклянные капилляры с вечным и внутренним диаметром, равные 1,5 миллиметра и 1,12 миллиметра соответственно. Потяните капилляр с п1000 шкивом. Во-первых, введите потянув программы.
Во-вторых, поместите капилляр в держатели и затяните их. В-третьих, начать программу и принять два вытащил микрокапилляров. Вырезать капиллярный кончик, вручную скальпелем, под стереомикроскопом, чтобы получить наконечник с внешним диаметром 200-250 микрометров.
Наконец, поместите капилляры на пластилиновую опору в закрытую чашку Петри и перенесите ее под капот. Дезинфицировать оптические волокна и поместить их под капот. Смешайте EGTA и Fast Green мастер смеси, чтобы подготовить раствор трассировщика клеток, и поместите его снова под капотом.
Вырезать небольшие кусочки лабораторной герметизации пленки для клеток подвески кровянистые пятна. И, наконец, подготовить раствор 1 миллиграмм на миллилитр стерильных доксициклина удаляются в 0,3 миллилитров шприца. Инъекционная трубка готовится из двух латексных трубок.
Исправить жесткий пластиковый кусок рта на один конец латексной трубки. Затем, исправить капиллярный держатель на один конец другой латексной трубки. Соедините свободные концы двух латексных трубок из стерильного фильтра диаметром 0,45 микрометра в качестве барьера против микробов оператора.
Поместите полученную сборку аспираторной трубки на пластилиновый держатель, который будет храниться под капотом. Сбор, тестирование и контроль нейросфер в отдельных трубках. Центрифуга нейросферы суспензии и заменить супернатант PBS.
Повторите эту последовательность еще два раза. Центрифуга нейросферы суспензии, заменить супернатант на трипсин раствор, и пипетка ячейки гранулы вверх и вниз, 4, 5 раз. Оставьте клетки в инкубаторе на пять минут, чтобы получить одноклеточную подвеску.
Блок трипсина с раствором ингибитора трипсина. Центрифуги клетки, и повторно приостановить их в свежей среде пролиферации. Подсчитайте клетки двух бассейнов и отрегулируйте их концентрацию до 100 000 клеток на микролитер в пролиферативной среде.
Затем смешайте тест и контрольные клетки 1:1 и проверьте полученную смесь под микроскопом флуоресценции. Наконец, поместите смесь на лед под капотом. Подготовь клетку с матерью и щенками на столе вдали от хирургической зоны оператора.
Поместите клетку восстановления на тележку. Положите смесь опилок, взятых из клетки матери на его дно, и поместите клетку восстановления под лампой. Помимо этого, установите ледяную коробку, покрытую алюминиевой фольгой для анестезии щенков P0.
Непосредственно перед трансплантацией добавьте раствор трассировщика от 1 до 10 томов в один объем клеточной суспензии и наметите три микролитров полученной смеси на кусок лабораторной герметизации пленки. Поместите щенка на холодную алюминиевую фольгу на одну минуту и убедитесь, что он полностью анестезировался. Между тем, аспирировать 3 микролитров инъекции смеси в стеклянный капилляр.
Аккуратно протрите голову обезболивающего щенка 70%этанолом. Затем найдите его на оптическом волокне, чтобы четко определить корковые полушария. Введите капилляр в передней и доступ к желудочковой полости.
Делая это, обратите внимание, чтобы не повредить кровеносные сосуды. Чтобы предотвратить повреждение ганглионной высокоты, поверните иглу боковой на тридцать градусов. Аккуратно ввилите клетки в полость и следите за их диффузией с помощью fast Green.
Подождите пять-десять секунд. Удалите стеклянную иглу, заботясь, чтобы не аспирировать клеточной подвески, и выбросить его в подходящий ящик для удаления. Перед выздоровлением щенка от наркоза ввисьте 150 микролитров докси-раствора интраперитонально, чтобы после трансплантации трансгенное выражение все еще было выключено.
После инъекции поместите щенков сразу под лампу для восстановления. Оставьте щенков там на пять-десять минут, и как только они полностью проснуться, поместите их в клетку с матерью. Наблюдайте за оперировать щенков в течение двух-трех часов, чтобы убедиться, что мать принимает их.
Поставка клетки с питьевой водой, содержащей 0.5mg/mL доксициклин и сахароза, для поддержания трансгенного выражения. Замените доксициклин, содержащий воду, на воду без докси через четыре дня после трансплантации. Таким образом активизируют транс-ген в постмитотических нейронах.
Держите мышей в режиме без доксов в течение шести дней, и усыпить их на P10. Исправить мозг от усыпленных щенков в 4%PFA, при четырех градусах, в одночасье. Удалите раствор PFA и замените его раствором 30% сахарозы.
Оставьте мозг на четыре градуса, пока они не опускаются до дна флакона. Перенесите мозги в одноразовую встраиваемую форму примерно наполовину заполненную крио-инклюзивной средой. Заморозить включенный мозг при 80 градусах.
Вырезать 60 микрон толщиной корональных секций с помощью криостата. Обработать разделы для анти-GFP, анти-RFP иммунофторесценции и противоустовать их с daPI решения. Установите рабочие параметры конфокального микроскопа соответствующим образом, как показано на показано.
Сбор фотографий иммуноанализа ломтиками, выбрав GFP положительные нейроны богатых фотографических полей слепой распределения сигнала RFP. Экспорт изображения в виде файлов ND2 и генерировать максимальные z-проекции из них, как TIFF файлов. Чтобы обеспечить последующую скелетизацию нейронов слепой генотипа клеток, скрыть красный сигнал.
Для этого добавьте слой регулировки. Выберите уровни, выберите красный. Установите выход к нулю.
И сохранить файл как таковой. Скелетизация впоследствии выполняется новым оператором, который ранее не имел доступа к оригинальным простым красным файлам. Для каждого скрытого красного файла откройте файл, добавьте слой чертежа к первичному изображению и выберите карандашный инструмент.
Отслеживать сомер на основе сигнала GFP. Затем проследить невриты. Наконец, сохраните файл mutlilayer, включая нейронные силуэты.
Последующий анализ нейрональных скелетов может быть выполнен либо оператором. Откройте каждый файл mulitlayer, создайте новые пустые 16-битные серые файлы с черным фоном. По одному на нейрон.
Копировать и вставлять одиночные нейронные силуэты, от основного изображения, до серых файлов. Вернитесь к многослойному файлу и выключите слой регулировки, чтобы раскрыть генотипы нейронов. Сохраните 16-битные серомасштабные файлы, аннотируя соответствующие генотипы нейронов.
Импорт серых изображений в ImageJ один за другим, и анализировать скелеты NeurphologyJ плагин. Соберите выбранные первичные данные NeurophologyJ, общую площадь длины нейрита, точки вложения и конечные точки, в электронную таблицу и используйте их для вычисления вторичных морфометрических параметров. Инженерный протокол, который мы предлагаем, позволяет сотрансдуцирует подавляющее большинство нейронов, подлежащих исследованиям, с предназначенными наборами трансгенов.
Кроме того, это позволяет достичь существенной однородности уровней экспрессии трансгенов в популяции трансиндированных клеток. Ключевой особенностью нашей процедуры является парная конфигурация. Тест и пул прекурсоров управления отдельно спроектированы, смешаны 1:1 и, наконец, совместно пересажены.
Такой парный подход облегчит обнаружение различий в результатах, конкретно связанных с отдельными генотипами. В этом примере мы проанализировали корональных секций пересаженных щенков, через десять дней после интервентулярной совместной инъекции Foxg1 чрезмерного выражения прекурсоров нейронов и контроля из них. Изображения групп нейронов были приобретены с помощью конфокальной микроскопии.
Для расчета максимальных проекций использовались файлы с стеками. Нейрональные силуэты прослеживались вручную. Здесь, зеленые и желтые силуэты представляют Foxg1 чрезмерного выражения и контроля нейронов, соответственно.
Наконец, первичные параметры, полученные в результате анализа NeurphologyJ, были использованы для расчета вторичных морфометрических индексов, как показано на примере. Это простой протокол, который позволяет исследователю оценить влияние, которое смешанное выражение данного гена, может оказать на тонкий контроль развития нейрита darth in vivo. Основными преимуществами этого протокола являются два.
Существующее количество генов, участвующих в морфогенезе нейронов, может быть функционально охарактеризовано in vivo, при отсутствии соответствующих тератогенных линий. И меньше животных необходимо для анализа, чтобы получить значительные статистические результаты.
