Анализ ddTRAP обеспечивает возможность получения чувствительного, надежного и высококоличебного измерения энзиматической активности теломеразы в клетках. Возможность работать до 96 образцов за запуск в средней пропускной способности моды предлагает нам большое преимущество. Мы можем запустить элементы управления и репликации для надлежащего статистического анализа собранных данных.
Непосредственно перед лизированием клеток оттаивает замороженный алицит буфера лиза NP-40. После размораживания поместите буфер лиза на лед. Добавьте ингибитор протеазы PMSF в буфер лиза NP-40, чтобы достичь конечной концентрации 0,2 миллимолара.
Затем добавьте 40 микролитров буфера лиза в трубку, содержащую клеточные гранулы, чтобы достичь эквивалентности клеток в 25 000 клеток на микролитер. Аккуратно пипетки лишат вверх и вниз, чтобы взломать клетки. Старайтесь избегать пузырей.
Дайте клеткам пролизировать на льду в течение 30 минут. Аккуратно вихрь лисировать каждые 10 минут, чтобы предотвратить образование кластеров клеточного мусора. Во время клеточного лиза, подготовить мастер смесь в микроцентрифуге трубки для реакции расширения теломеразы, и хранить на льду.
После клеточного лиза пипетка 48 микролитров расширения мастер перемешать в каждой трубке ПЦР. Добавьте два микролитров разбавленного лизата к каждой трубке ПЦР, чтобы достичь окончательной эквивалентности клеток в 50 клеток на микролитр, и продолжить реакцию расширения теломеразы в соответствии с рукописью. Подготовка мастер смесь в микроцентрифуг трубки для ddTRAP, и держать его при комнатной температуре.
Pipette 19.8 микролитров ddPCR мастер смеси в каждой трубке ПЦР. Добавьте 2,2 микролитров предыдущего раствора реакции расширения к каждой трубке, оставляя общий объем 22 микролитров. Чтобы настроить картридж для генерации капель, сначала загрузите 20 микролитров подготовленного раствора в средний образец хорошо в картридже.
Аккуратно нажмите на сторону картриджа, чтобы переместить любые пузырьки в верхней части раствора. Все скважины картриджа должны быть загружены образцом до погрузки масла. Затем загрузите 70 микролитров масла капельного производства в левую нефтяную колодец.
Защитите прокладку на месте, привязав ее к концам картриджа, и поместите загруженный и собранный картридж в генератор капель. Генератор показывает твердый зеленый свет, чтобы сообщить картридж находится должным образом. Через 60-90 секунд, когда свет генератора перестает мигать, цикл завершается.
Теперь удалите картридж. Аккуратно снимите прокладку с картриджа. Используйте многоканальный пипетку для пипетки около 40 микролитров вновь генерируемых капель из правого а в 96-хорошо ПЦР пластины.
Тепло печать пластины с алюминиевой фольгой ПЦР пластины уплотнения, как только все образцы загружаются в 96-хорошо пластины для предотвращения испарения. Затем загрузите пластину 96-колодец в термоциклер для выполнения реакции ПЦР. Для начала загрузите пластину 96-колодец в капельный считыватель.
Ориентация пластины правильно так, что образец A1 совпадает с образцом владельца. Откройте программное обеспечение, связанное с считывателем капель. Дважды нажмите на первую колодец, A01, чтобы открыть образец хорошо редактор экрана.
Нажмите Эксперимент, и выберите тип анализа, который будет использоваться из выпадают меню. В качестве правильного метода обнаружения выберите qX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Нажмите Применить в нижней правой стороне экрана редактора колодца, чтобы сохранить пользовательские настройки для всех выделенных скважин.
Далее нажмите на Target на экране редактора хорошо и нажмите на меню «Целевое падение», чтобы выбрать неизвестный, справочный или нет-шаблонный элемент управления для определения типа образца. В разделе «Имя образца» наклеить все образцы и щелкнуть Apply. Нажмите Run, чтобы прочитать тарелку.
Выберите либо столбцы, либо строки на экране Run Options, когда вам будет предложено сообщить о ориентации, в которую должна быть прочитана пластина. Определите количество принятых капель для каждого образца, дважды нажав на отдельные скважины или столбец и заготовки рядов, чтобы предоставить таблицу информации. Для ddTRAP для дальнейшего анализа действительны образцы с 10 000 или более принятыми каплями.
Выделите скважины, представляющие образцы репликаций и образцы NTC. Вручную установите порог для образцов, нажав на значок для установления порогов в левом нижнем углу экрана. В этом протоколе активность теломеразы измерялась в клеточной панели, состоящей из девяти клеточных линий рака легких и теломеразы-отрицательных фибробластов.
Порог был установлен на уровне около 2000 флуоресцентной амплитуды для всех трех биологических репликаций для SHP77, H2887 и NTC. Положительные капли имели интенсивность флуоресценции около 6000 флуоресцентной амплитуды, которая сформировала ясную популяцию в верхней части, и отделена от отрицательных капель около 1100 амплитуды флуоресценции. Общий объем продуктов расширения теломеразы на клеточный эквивалент между всеми образцами оценивался на основе измеренной концентрации нуклеиновых кислот, что представляет собой активность теломеразы в линиях рака легких.
Любое загрязнение RNase во время лиза или расширения реакции шаги уничтожит теломеразы энзиматической активности, поскольку это рибонуклеопротеин комплекса. ddTRAP может сопровождаться ddPCR на уровнях экспрессии hTERT mRNA в клетке. Эти два набора данных позволяют нам соотносить выражение hTERT с активностью теломеразы и глубже углубляться в потенциальные механизмы регулирования теломеразы, такие как альтернативное сращивание.
Мы можем исследовать манипуляции с конкретными факторами сращивания и их влияние на активность теломеразы. В настоящее время мы разрабатываем олигонуклеотидные модуляторы для сплайсинга в качестве потенциальных препаратов, нацеленных на активность теломеразы.
