Этот протокол может быть использован для точного измерения количества копий митохондриальной ДНК, присутствующих в отдельных клетках, и уровня определенных типов мутаций митохондриальной ДНК. Предыдущие методы могут точно проводить эти измерения в образцах тканей, содержащих много клеток. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем производить одинаковые измерения в отдельных клетках.
Этот метод особенно полезен для тех, кто изучает митохондрии, и будет иметь широкое применение в этой области. Эффективное выделение и лизис отдельных клеток является ключом к этой технике. Предыдущий опыт сортировки одной ячейки был бы очень полезен.
Для начала подготовьте мастер-микс для ПЦР без образца ДНК на льду, как описано в тексте. После кратковременного вихря распределите необходимый объем приготовленной мастер-смеси на каждую лунку капельной генерации ПЦР-96-луночной пластины, расположив образцы в полные колонки. Затем добавьте основное сочетание в любую пустую ячейку в неполных столбцах для использования в качестве элементов управления, не относящихся к шаблонам.
Затем добавьте входную ДНК к каждой скважине, чтобы сделать общий объем каждой лунки 22 микролитра. Запечатайте пластину клейким уплотнением и поместите ее на шейкер при 2000 об/мин в течение одной минуты. Затем центрифугируйте пластину в 1000 раз G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, прежде чем поместить ее на лед.
Для генерации капель сначала убедитесь, что генератор капель включен, и проверьте, загружена ли бутылка капельного масла в положение E на палубе прибора. Затем нажмите «Настроить образец пластины» на сенсорном экране. После выбора всех столбцов на табличке с образцом, содержащей образцы или заготовки, нажмите кнопку ОК, чтобы подтвердить конфигурацию пластины.
Затем загрузите картриджи генератора капель в положение B на палубе прибора, чтобы все огни стали зелеными, и поместите пустой желоб для отходов наконечника в положение C. Затем загрузите коробки с наконечниками фильтра со снятыми крышками, чтобы позиционировать D на сцене прибора, чтобы все огни стали зелеными. Затем снимите клейкое уплотнение перед загрузкой пластины образца в положение F приборной палубы так, чтобы свет стал зеленым. Также загрузите пустую капельную коллекционную 96-луночную пластину, помещенную в холодный блок, предварительно охлажденный при минус 20 градусах Цельсия, в положении G так, чтобы свет стал зеленым.
Нажмите «Начать генерацию капель» на сенсорном экране прибора, и крышка генератора капель автоматически закроется. После завершения генерации капель визуально проверьте пластину сбора проб, чтобы подтвердить, что слой капельной эмульсии присутствует над масляной фазой в каждой скважине. Далее включите герметик пластины и установите температуру на 180 градусов цельсия и время уплотнения до пяти секунд.
Дайте машине достичь рабочей температуры. Затем поместите пластину для сбора проб на держатель пластины герметика пластины и поместите уплотнение из свежей фольги на верхнюю часть пластины с красной линией, обращенной вверх. Когда уплотнитель пластины достигнет своей рабочей температуры, нажмите кнопку извлечения на сенсорном экране прибора.
После размещения держателя пластины в ящике герметика пластин нажмите на уплотнение, чтобы закрыть ящик. Как только уплотнение будет завершено, ящик автоматически откроется. Снимите герметичную пластину и поместите ее на холодный блок.
Затем выключите герметик пластины. Для проведения ПЦР поместите герметичную пластину для сбора капель в ПЦР-машину с блоком 96 глубоких скважин. После завершения ПЦР включите устройство считывания капель и подключенный компьютер.
Загрузите пластину с образцами после ПЦР в держатель пластины капельного считывателя. Удерживая крышку фольги на пластине для образцов, поместите крышку на верхнюю часть держателя и закрепите ее на месте с помощью черных зажимов. Далее, чтобы открыть крышку капельного считывателя, нажмите кнопку открытия/закрытия.
Затем загрузите держатель пластины капельного считывателя с пластиной образца в камеру считывателя и надежно поместите его на магнитное основание. Нажмите кнопку открытия/закрытия еще раз, чтобы закрыть крышку. Откройте интерфейс аналитического программного обеспечения.
Перейдите на вкладку Добавить пластину, нажмите кнопку Добавить пластину, а затем Настроить пластину. На вкладке Информация о пластине введите имя пластины, выберите Супермикс для зондов, No DUTP в раскрывающемся меню Supermix и введите имя файла в разделе Сохранить файл данных As.In вкладке Выбор скважины, выделите анализируемые скважины и нажмите включить выбранные скважины. Затем на вкладке Информация о скважине выберите скважины для аннотирования.
Выберите Прямая количественная оценка в раскрывающемся меню Тип эксперимента. Затем заполните поля описание образца, тип образца и имя целевого объекта, а также при необходимости добавьте примечания к колодцам и/или заметки на пластине. Затем нажмите кнопку Применить.
После завершения настройки пластины нажмите кнопку Начать запуск. Для анализа результатов выберите вкладку Анализ данных и откройте файл для анализа в меню Мои файлы данных. Затем перейдите на вкладку «Амплитуда 1D» для одноцветных экспериментов или вкладку «Амплитуда 2D» для двухцветных экспериментов.
Далее выбираем скважины, требующие пороговых значений. Используйте инструмент Threshold Line Mode, чтобы вручную применить пороговое значение в свободном пространстве между положительной и отрицательной популяциями на амплитудном графике, гарантируя, что перекрестие расположено таким образом, что четыре популяции капель четко разделены. После применения порогового значения ко всем образцам экспортируйте результаты в виде CSV-файла для дальнейшего анализа, щелкнув вкладку Таблица данных Импорт/экспорт и выбрав Экспорт видимых данных в CSV.
Введите подходящее имя файла и нажмите кнопку Сохранить. Процедуры ПЦР и считывания капель, используемые в этом протоколе, продемонстрировали наличие четко разделенных популяций положительных и отрицательных капель, как в fam, так и в шестнадцатеричных каналах. Популяции митохондриальной ДНК, положительные для обоих зондов, также можно отличить от одноклеточных лизатов.
Этот метод также показал, что для образцов с делециями в митохондриальной ДНК присутствует смешанная популяция двойных положительных капель и капель, положительных только на неудаленную часть ДНК. Этот метод был успешно использован для подсчета числа копий митохондриальной ДНК на клетку в различных клетках млекопитающих, включая мышиные ооциты и первичные эмбриональные клетки мыши. Кроме того, в клетках с высокой делецией гетероплазмы популяция, положительная для одного зонда, была значительно больше, чем двойная положительная популяция.
Однако в клетках с гетероплазмой с низкой делецией обе популяции были одинакового размера. Таким образом, точные результаты всегда гарантируют, что генерация капель была успешной и что пороговое значение было соответствующим образом применено с использованием 1D или 2D амплитудного вида. Неиспользуемый лизат может быть использован для других одноклеточных анализов, таких как пиросеквенирование, которое может измерять гетероплазму однонуклеотидного полиморфизма.
Развитие этой методики позволило провести точные измерения числа копий митохондриальной ДНК и делеции гетероплазмы в отдельных клетках, что ранее было невозможно.
