Характеристика связывания белка с РНК in vivo остается серьезной проблемой из-за сложного характера РНК и многих факторов, влияющих на ее взаимодействие с белками. РНК связывания белка или RBP-РНК сродство измеряется внутри живых бактериальных клеток. Поскольку клеточная среда влияет как на структуру РНК, так и на связанную с ней связывание RBP-RNA, измерение сродства in vivo имеет решающее значение для понимания таких взаимодействий в естественных системах.
Секрет успеха заключается в дизайне плазмидов. Конструкция должна использовать несколько волн дельты и избегать вставки стоп-кодонов и мутаций рама. Начните этот протокол с разработки кассеты обязательного сайта.
Каждый мини-ген содержит сайт ограничения EagI, 40 оснований из пяти основных конце гена резистентности к канамицину, промоутер pLac/Ara, рибосомный связывающий участок, AUG гена mCherry, спейсера, сайта связывания RBP, 80 баз из пяти основных концов гена mCherry и места ограничения ApaLI. Чтобы увеличить успешное значение анализа, спроектировать три связывающие кассеты сайта для каждого обязательного сайта с проме сторонами, состоящими по крайней мере из одной, двух и трех баз. Двойной дайджест как мини-генов, так и целевого вектора с EagI HF и ApaLI перед выполнением очистки колонки дайджестов.
Ligate переваренных мини-генов к связыванию позвоночника сайта, содержащего остальную часть гена репортера mCherry, терминатор и ген резистентности к канамицину. Затем трансформируете раствор перевязки в верхние 10 клеток Escherichia coli. После выявления положительных трансформантов с помощью секвенирования Sanger храните очищенные плазмиды в формате 96 хорошо при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Также хранить бактериальные штаммы, как глицерол запасов в формате 96 хорошо при минус 80 градусов по Цельсию. Пользовательский порядок требуемой последовательности RBP без стоп-кодона в качестве двухместного мини-гена ДНК с местами ограничения на концах. Превратите подготовленные плазмиды в химически компетентные бактериальные клетки, уже содержащие плазмиду RBP mCerulean.
Чтобы сэкономить время, пластины клеток с помощью восьми каналов pipetter на восьми полосах пластин, содержащих Лурия-Бертани агар с соответствующими антибиотиками. Колонии должны появиться в 16 часов при 37 градусах по Цельсию. Выберите одну колонию для каждого двойного трансформанта и перенесите на 48 пластинок, содержащих 1,5 миллилитров LB с соответствующими антибиотиками.
Выращиваем клетки в течение 18 часов при 37 градусах по Цельсию при 250 об/мин. Храните ночевки в виде запасов глицерола при температуре минус 80 градусов по Цельсию в 96 хорошо пластин. Утром запрограммировать робота на прогрев 180 микролитров полупорной среды или SPM в 96 пластинах.
Запрограммировать робота для подготовки индукторной пластины. В чистой пластине 96 скважин, подготовить скважины с SPM, состоящий из 95%BA и 5%LB. Количество скважин соответствует желаемому количеству концентраций индукторов.
Добавьте C4-HSL к скважинам в индукторной пластине, которая будет содержать самую высокую концентрацию индуктора. Далее запрограммировать робота на серийное разбавление среды от каждой из скважин с самой высокой концентрацией до 23 более низких концентраций от нуля до 218 наномолярных. Объем разбавления каждого индуктора должен быть достаточным для всех штаммов.
Чтобы разбавить ночные штаммы, запрограммировать робота разбавить в 10 раз, смешивая 20 микролитров бактерий со 180 микролитров SPM в 48 пластинах. Затем разбавляют снова в 10 раз, принимая 20 микролитров из разбавленного раствора в заранее подготовленный штамм пластины подходит для флуоресцентных измерений. Теперь запрограммировать робота, чтобы добавить разбавленный индуктор от индукторной пластины до 96 пластин хорошо с разбавленных штаммов в соответствии с окончательными концентрациями.
Встряхните 96 пластин при 37 градусах по Цельсию в течение шести часов. В течение этого времени, принять измерения оптической плотности или OD на 595 нанометров, а также mCherry и mCerulean флуоресценции через пластины читателя каждые 30 минут. Для целей нормализации измерять рост SPM без добавления ячеек.
Здесь показаны трехмерные участки для положительного напряжения. Участки изображают необработанные уровни OD, флуоресценцию mCerulean и флуоресценцию mCherry как функцию времени и концентрации индуктора. уровни экспрессии mCerulean с устойчивым состоянием были вычислены для каждой концентрации индукторов как для положительных, так и для отрицательных штаммов.
Скорость производства mCherry также была вычислена для каждой концентрации индуктора как для положительных, так и для отрицательных штаммов. Скорость производства mCherry была построена как функция средней флуоресценции mCerulean в среднем более двух биологических дубликатов для двух штаммов. Пригонка KRBP используя приспосабливая формулу показана для положительного напряжения exhibiting специфический связывая ответ.
Для отрицательного штамма значение KRBP не было извлечено. Нормализованные кривые реакции дозы были определены для 30 различных штаммов на основе двух RBPs как 10 связывающих участков в разных местах. Наблюдаются три типа ответов: высокое сродство, низкое сродство и отсутствие сродства.
Здесь показаны количественные результаты KRBP для двух RBPs, MS2 пальто белка и PP7 белка пальто с 10 различных связывающих кассет сайта. Кривые реакции дозы для белка MS2 пальто с мутантом связывания сайта в четырех различных местах показаны здесь, чтобы продемонстрировать влияние мутантного интервала на производство mCherry. Показана последовательность тестировавшего мутировавшего сайта связывания.
Важно использовать структурную технику, такую как форма, направленную на химический зонд структуры белково-РНК-комплекса и визуализацию того, какие регионы мРНК страдают от связывания РНК. В последнее время мы использовали этот метод в высокой пропускной способности образом одновременно измерить близость RBPs до 10000 обязательных сайтов.
