Метод основан на программном обеспечении с открытым исходным кодом для систематической оценки локальной двигательной активности для отслеживания поведения взрослых особей и личинок мух по записанному видео. Этот метод требует недорогой интеграции устройств для записи и анализа поведения, что делает его доступным и эффективным подходом к скринингу передвижения мух. Эта технология используется для выявления поведенческих модификаций в модели заболевания человека мухи с локальным нарушением движения, но она не подходит для лечения болезней, инвалидности или трудностей.
В процессе анализа важно очистить соответствующее видеоокно, а именно исходное и обрабатывающее видеоокно. Для начала смешайте реагент А и реагент В набора кремнезема в соотношении один к 10 в соответствии с инструкциями производителя, чтобы подготовить арену открытого поля для отслеживания локомоции дрозофилы. Далее установите HD-камеру на штатив, отрегулировав его так, чтобы объектив камеры был перпендикулярен поверхности кварцевой арены.
Затем откройте видео с Фиджи. Перетащите индикатор выполнения в начальный кадр и молчаливо одобрите. Выберите все тело мухи с помощью инструмента выбора от руки.
Нажмите на изображение, отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы настроить баланс белого, пока значение серого выбранной области не приблизится к широкому фону. Перенесите обезболивающую муху на арену открытого поля. Как только муха оправится от анестезии, поместите тарелку с мухой под камеру и быстро встряхните ее из стороны в сторону, чтобы убедиться, что муха находится в движении, когда начинается запись.
Нажмите кнопку записи в приложении камеры, чтобы начать запись видео. По завершении записи нажмите кнопку остановки, чтобы прервать запись видео. Конвертируйте записанные видео в формат AVI с языческим кодированием M-J, чтобы их можно было открывать и анализировать с помощью Fiji.
Также установите количество кадров в секунду видео на 15 кадров в секунду для взрослых мух и 12 кадров в секунду для личинок. Чтобы открыть видео с Фиджи, выберите два варианта: использовать виртуальный стек и преобразовать в оттенки серого во всплывающем окне. Получите окно обработки с помощью инструмента «Установить активное изображение» плагина отслеживания животных и создайте область отслеживания, которая окружает арену в исходном видеоокне, с помощью инструмента «Овал».
Установите фильтры и параметры двух фильтров для первого пустого кадра в окне обработки. Затем выберите следующий кадр в исходном окне видео и выберите отфильтрованную поверхность окна обработки. После того, как отфильтрованное окно обработки выбрано, используйте инструмент «Установить порог», чтобы повернуть мушку тракта с красным профилем, закрытым окном обработки.
Затем используйте установленный детектор больших двоичных объектов, чтобы компьютер мог распознать муху с красным профилем, закрытым в окне обработки. Установите последний кадр для взрослой мухи или личинки, как описано в текстовой рукописи. Используйте инструмент «Показать большие двоичные объекты», чтобы отобразить прямоугольник отслеживания в исходном окне видео.
Запустите отслеживание и экспортируйте файл отслеживания после завершения мониторинга. Загрузите файлы треков и зон с помощью плагина для отслеживания животных и анализатора отслеживания. Выберите нужный индекс с помощью настроек зоны и измените настройки параметров.
Рассчитайте время интервала кадров, используя частоту кадров. Создавайте диаграммы количественного анализа с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и призмы графической площадки после анализа в анализаторе отслеживания. Откройте файл трека.
Скопируйте все координаты в Microsoft Office Excel и разделите ячейки с помощью клавиши пробела. Чтобы вычислить время неподвижности за интервал кадра, выделите все вычисленные результаты и вставьте гистограмму, чтобы визуально отобразить время неподвижности на полях всей гистограммы. Чтобы проиллюстрировать изменения угла направления, выделите все вычисленные результаты и вставьте точечную диаграмму.
Взрослые мухи и личинки третьего возраста, получавшие ротенон, имели значительный дефицит опорно-двигательного аппарата по сравнению с контрольными мухами, которых кормили растворителем ДМСО. Количественный анализ лечения ротеноном взрослых мух показал значительное снижение пройденного расстояния и средней скорости. И значительное увеличение времени неподвижности.
Репрезентативные графики показали меньшее количество пиков скорости движения за интервал кадра у мух, которых кормили ротеноном, по сравнению с мухами в контрольной группе, что указывает на серьезность дефицита двигательной активности. Институциональная неподвижность столбца перемещенных пикселей на кадр также показала значительно меньшее движение в течение одной минуты для мух, которых кормил Ротенон, по сравнению с контрольными мухами. Репрезентативные графики, иллюстрирующие угол перемещения изменений направления кормления ротеноном, и контрольные животные также показали изменения в направлении, выбранном мухами.
Аналогичные результаты наблюдались для личинок третьего возраста. Результаты показали, что поведенческое движение отслеживающих личинок, получавших ротенон, было значительно нарушено по сравнению с контролем. Наиболее важным шагом в процессе анализа является формирование первого пустого кадра, поскольку он свидетельствует о том, может ли программное обеспечение эффективно проверять.
Эта технология может позволить исследователям глубже вникнуть в основной механизм множественных дефектов, таких как повреждение нерва или мышцы.
