Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Метод является высокоэффективным методом изоляции эндотелиальных клеток от миниатюрной свиньи. И клетки могут быть расширены тоже, исследовать иммунный и коагуляционной реакции в ксенотрансплантации. Основным преимуществом техники является то, что не только легко, высокоэффективно изолировать высокоочищенные клетки эндотелия от свиньи, но и лучше для хранения других пЭК при прохождении.

После подтверждения отсутствия реакции на болевой рефлекс у обезболивающей свиньи, мыть свиной брюшной стенки три раза с 75%медицинского алкоголя, и одна настойка йода. После последней стирки используйте скальпель, чтобы сделать разрез брюшной полости, чтобы разоблачить нижнюю каву вены, и использовать пятимиллилитровый шприц для введения 5000 единиц гепарина натрия в нижнюю каву вены. Через пять минут вставьте катетер в брюшную аорту и используйте скальпель, чтобы перерезать диафрагму.

С помощью второго следователя, удалить левый желудочек и использовать костные миппы, чтобы подакцизных ребер подвергать сердце и легкие. Найдите заднюю аорту к сердцу и легким, и зажим концы. Используйте ножницы, чтобы вырезать аорту, и мыть его один раз с предварительно охлажденным буфером стирки.

Удалите излишки ткани вокруг аорты стерильными типсами и ножницами и поместите сосуд в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую свежий предварительно охлажденный буфер для переноса в лабораторию. Для изоляции морских аортальных эндотелиальных клеток перенесите свиную аорту в 150-миллиметровую чашку Петри в асептических условиях и аккуратно удалите оба конца сосуда. Обрезать любые дополнительные избыточные ткани, где судно было зажато, с стерильными типсами и ножницами, и использовать от 20 до 50 миллилитров свежего буфера стирки для полоскания снаружи и внутри аорты.

Далее пройдите хирургический шов через аорту и свободно свяжите один конец сосуда, сохраняя шов в люмене. Аккуратно зафиксьте аорту возле связанного конца типсами, а затем медленно потяните хирургический шов, чтобы обратить вспять аорту, пока не будет выставлена эндотелиальная поверхность аорты. Вымойте эндотелиарной поверхности аорты три раза с 10 миллилитров свежего буфера стирки на стирку, и место аорты в 15 миллилитров центрифуги трубки.

Обложка образца с 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию нагревается 0,005%коллагеназы IV пищеварительного раствора, и инкубировать ткани при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. В конце инкубации перенесите все содержимое трубки в 100-миллиметровое культурное блюдо и остановите пищеварение с помощью 10-15 миллилитров предварительно охлажденные остановочку буфера. Используя клеточный скребок, аккуратно удалите аортальные эндотелиальные клетки с внутренней поверхности сосуда и трижды помойте сосуд пятью миллилитров стирального буфера на стирку.

После последней стирки, передача supernatant в 50 миллилитров центрифуги трубки, и мыть дно культуры блюдо два раза с пятью миллилитров свежего буфера стирки, за стирку, потянув моет в 50 миллилитров трубки. Соберите клетки путем центрифугации, и отбросить все, кроме последних 10 миллилитров супернатанта. Добавьте 20 миллилитров стирального буфера, чтобы повторно использовать гранулы, заботясь, чтобы избежать пузырьков, и собирать клетки с другой центрифугации.

Resuspend гранулы в один миллилитр клеточной культуры среды для подсчета, и пластины клеток в один раз от десяти до шести клеток на 25 сантиметров в квадрате концентрации колбы. Затем поместите клетки в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа, освежая среду каждые два-три дня. После изоляции эндотелиальные клетки проверяются на нулевой день, один и два, а после проходов один и два для загрязнения и их морфологической оценки.

Цитометрический анализ потока с использованием анти-CD31-FITC антитела указывает, как правило, больше, чем 97%эндотелиальных клеток маркер положительной популяции на третий день культуры, которая поддерживается на более чем 90% чистоты даже после двух проходов. Эндотелиальная поверхность аорты была соскоблена только в одном направлении, с сотовым скребок, менее 10 раз, и он не был сжат в процессе соскабливания. Лучший ответ, оптимизированный метод изоляции пЭК, мы можем использовать очищенные ПЭК для проведения индивидуальных экспериментов и исследования иммунного отторжения и коагуляции в ксенотрансплантации.