Протокол демонстрирует надежный и воспроизводимый метод выделения и культивирования эндотелиальных клеток высокой чистоты у мышей, который может иметь несколько применений. Этот метод является более простым методом, который сохраняет выход и чистоту эндотелиальных клеток. Продемонстрирует процедуру Нина Нгуен, штатный научный сотрудник моей лаборатории.
Для начала покрутите магнитные шарики в течение нескольких секунд. Пипетка 50 микролитров шариков в две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки для CD31 и CD102. Добавьте один миллилитр буфера для промывки шариков и хорошо перемешайте.
Поместите пробирки на магнитный сепаратор и удалите надосадочную жидкость стеклянной пипеткой Пастера. Ресуспендируйте шарики в 50 микролитрах буфера для промывки шариков. Затем добавьте пять микролитров или 2,5 микрограмма антител CD31 или CD102 к каждым 50 микролитрам шариков.
Инкубируйте суспензию шариков с легким вращением на концевом вращателе в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение трех часов при комнатной температуре. Промойте иммуношарики четыре раза, а затем ресуспендируйте иммуношарики в 50 микролитрах буфера для промывки шариков. В день изоляции добавьте 25 миллилитров HBSS к 25 миллиграммам коллагеназы первого типа и инкубируйте его с осторожной ротацией.
Затем отфильтруйте с помощью 22-микрометрового фильтра. После эвтаназии пяти-семидневного детеныша мыши опрыскайте тушу 70% этанолом. Затем разрежьте диафрагму вверх вдоль всех боковых стенок грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость.
Введите пять миллилитров холодного DMEM в правый желудочек сердца, пока легкие не побелеют. Затем разрежьте доли дистальнее соответствующих бронхов один за другим, чтобы удалить легкие. Вытяните доли легких в коническую трубку объемом 50 миллилитров, предварительно заполненную 20 миллилитрами ледяной базальной среды.
Осторожно помешивайте трубку вручную в течение 10-15 секунд, чтобы смыть лишние эритроциты. Извлеките легкие из среды с помощью клеточного ситечка и пропустите через мясорубку стерилизованными ножницами. Переложите измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров с 25 миллилитрами предварительно подогретого раствора коллагеназы.
Аккуратно перемешайте на вращающемся миксере. Присоедините шприц объемом 20 миллилитров к тупой канюле 15-го калибра и энергично растирайте суспензию, не вспенивая от 10 до 15 раз в клеточную суспензию. Отфильтруйте суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Затем промойте коническую трубку, используемую для пищеварения, и клеточное ситечко 15 миллилитрами базальной среды. Центрифугируйте клеточную суспензию в 400 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулы в двух миллилитрах полной среды.
Добавьте восемь миллилитров полной среды и инкубируйте ее. На следующий день дважды промойте колбы 10 миллилитрами HBSS без кальция и магния и добавьте 10 миллилитров готовой среды. Как только клетки сливаются на 90-95%, они готовы к первичному выделению иммуногранул.
Дважды промойте прилипшие эндотелиальные клетки 10 миллилитрами HBSS без кальция и магния. Добавьте два миллилитра раствора для отслоения клеток, не содержащего трипсина, и инкубируйте его, чтобы обеспечить подъем всех клеток из колбы. Добавьте восемь миллилитров базальной среды.
Затем раскрутите клетки до 400 раз G в течение четырех минут при комнатной температуре и ресуспендируйте их в двух миллилитрах базальной среды. Шарики с вихревым покрытием против CD31 в течение нескольких секунд, чтобы ресуспендировать бусины. Добавьте 30 микролитров шариков на каждые два миллилитра клеточной суспензии и закрепите крышку.
Инкубируйте пробирку в течение 10 минут при комнатной температуре на торцевом вращателе. Затем поместите трубки на магнитный сепаратор на две минуты. Аспирируйте надосадочную жидкость и извлеките трубку из магнита.
Ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки, добавив три миллилитра базальной среды в трубку и несколько раз пипетируя вверх и вниз. Замените трубку на магнитном сепараторе на две минуты. Затем тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
После окончательной промывки, когда надосадочная жидкость станет прозрачной, ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки в трех миллилитрах полной питательной среды и перенесите ее в колбу T75. Добавьте семь миллилитров полной питательной среды и инкубируйте ее. На следующий день повторно промыть клетки HBSS без кальция и магния.
Затем добавьте 10 миллилитров полной среды. Как только клетки сливаются на 90-95%, они готовы к вторичному выделению иммуногранул. Первый отбор иммуногранул идентифицирует CD31-положительные клетки, которые растут в булыжном образовании.
Второй выбор иммуногранул с шариками, покрытыми анти-CD102, увеличивает чистоту эндотелиальных клеток, а сортировка клеток, активированная флуоресценцией, используется для подтверждения того, что клеточная популяция является CD31-положительной и CD102-положительной. Для изучения воспалительных путей эндотелия и функции эндотелиального барьера лечение мышиным цитомиксом использовалось для индукции значительной продукции IL-6 эндотелиальными клетками со значением P менее 0,01. Кроме того, трансэндотелиальное сопротивление уменьшилось, показывая повышенную проницаемость эндотелия.
Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы для стимуляции эндотелиальных клеток или анализов барьерной функции для обнаружения терапевтических мишеней на основе эндотелия для нарушений эндотелиальной дисфункции.
