Механические свойства растительных клеток необходимо учитывать при попытке понять механизмы, лежащие в основе развития. Атомная микроскопия силы может быть использована для измерения этих свойств, и следить за тем, как они меняются, между органами, тканями, все этапы развития. Основными преимуществами этой техники, является то, что она не является инвазивной, она является относительно быстрой и не требует лечения, поэтому она может быть непосредственно применена к живым образцам.
Для кого-то, что является новым для этой процедуры, cis раздел образца действительно имеет решающее значение, поэтому убедитесь, что у вас действительно есть надлежащее механическое фиксации образца. Визуальная демонстрация этой процедуры, имеет решающее значение, чтобы лучше понять тонкости фиксации выборки, контроль качества способствует и измерения установки. Демонстрация процедуры будет Симона Бовио, инженер и Yuchen Лонг, пост документ в моей лаборатории.
Для начала поместите кусок двойной односторонней ленты в центр пятиметрового диаметра Петри-блюдо. Добавьте образец генезия, который был выделен из цветочного бутона в ленту. Быстро добавляйте воду в блюдо, пока образец полностью не будет покрыт, чтобы избежать обезвоживания.
Затем поместите образец на сцену AFM и переместите голову так, чтобы она была над образцом. После калибровки кантилевера в программном обеспечении убедитесь, что система находится в режиме ЗИ, и подойдем к образцу с силой точки набора из пятнадцати нано-ньютонов. Затем установите длину в четыре микрона и установите площадь сканирования до восьмидесяти на восемьдесят микрон в квадрате с числом пикселей, установленных до сорока на сорок.
Затем перейдите на расширенную панель настроек изображений и установите режим на постоянную скорость. Кроме того, набор расширить скорость введите трек до двухсот микрон в секунду, и скорость выборки до двадцати пяти килограммов герц. После того, как параметры были установлены, переместить наконечник в область интереса по образцу.
Убедитесь, что область для сканирования свободна от мусора, найдите область, которая является как можно более плоской, и занимайтесь, затем начните сканирование и используйте быстрое сканирование низкой силы, чтобы проверить, если образец движется. После того, как область, интересная как была расположена, выберите область, которая сорок сорок шестьдесят на шестьдесят Micron в квадрате, и увеличить число пикселей до двух пикселей на микрон. Затем увеличьте установленную точку до пятисот нано ньютонов, чтобы получить отступ от ста до двухсот нанометров.
Уменьшите длину до двух микрон, а также расширьте скорость введите тракт до ста микрон в секунду, затем увеличьте скорость выборки до пятидесяти килогерц и начните сканирование образца. После завершения сохраните выход как изображение, так и файл данных. Откройте программное обеспечение для обработки данных и загрузите файл данных.
Нажмите на эту карту для кнопки обработки пакетов, чтобы использовать те же параметры на всех кривых карты, а затем перейдите к загрузке предопределенного процесса и выберите hertz fit. Далее перейдите к переключаемой базовой линии операции, и установить вычесть, чтобы компенсировать плюс наклон, и X мин между сорока и шестидесяти процентов. На вкладке вертикального положения наконечника выберите на гладкой жесткой, если вы предпочитаете работать на необработанных данных.
Чтобы выбрать соответствующую модель подходят, перейдите на вкладку эластичности подходят, и выбрать один из вариантов на основе ожидаемой прочности адгезии. Если нет или слабой адгезии присутствует, то используйте кривую подхода и предпочитайте использовать модель hertz isnader. В случае более сильной адгезии используйте модель Dergen Milia Dortoprov или DMD и работайте на кривой задержки.
Теперь установите геометрические параметры наконечника на основе номинальной формы наконечника. Наконечник, используемый в этом эксперименте, является сферическим наконечником, с радиусом четыреста нанометров. Затем установите коэффициент Пуассона до 0,5 и выберите кривые сдвига.
Добавьте вторую эластичность подходят рутины, нажав на значок на главном окне, и повторить те же параметры настройки. Наконец, укажите желаемое отступы в X min, затем храните и нанесите на все, чтобы итерировать предыдущие шаги на всех кривых карты. Сохраните результаты для получения изображения в файле dot tsv.
Чтобы измерить с быстрыми изменениями раствора, смонтировать образец в чашке Петри, держа небольшой кусочек клея mastic. Быстро запечатайте зазор между мастиком и базой образца биосовместимым клеем. Подождите, пока клей затвердеет, а затем погрузить образец в жидкой вершины культуры среды, содержащей 0,1 процента смеси сохранения растений.
После калибровки системы откройте программное обеспечение для приобретения и перейдите первым к окну параметра проверки. Там установить пружинную константу для cantilever изготовлены пружинной постоянной или определяется пружинной постоянной. Затем установите радиус наконечника до четырехсот нанометров, коэффициент уравновешенности образца до 0,5, выборку линии до ста двадцати восьми, чтобы обеспечить быстрое приобретение, скорость сканирования до 0,2 герц и размер сканирования до одного микрона.
Затем перейдите к окну рампы и установите размер пандуса до пяти микрон, порог триггера до максимума, а количество образцов до четырех тысяч шестьсот восемь. Со всеми параметрами, тщательно подойди к образцу вручную. Когда зонд находится относительно близко к поверхности образца, нажмите на подход.
При контакте постепенно увеличивайте размер сканирования и изменяйте скорость сканирования до тех пор, пока не будет достигнут желаемый баланс, не повредив образец или наконечник. Переместите сканирование, если область измерения не является желаемой. Когда удовлетворены, нажмите кнопку, точка и стрелять, чтобы инициировать точку и стрелять окно.
Укажите каталог сохранения и имя файла. Затем нажмите пандус на следующем сканировании, чтобы инициировать запись. Когда сканирование будет завершено, программный интерфейс будет перенаправлен в окно рампы.
Нажмите на отсканированное изображение, чтобы указать позиции отступа. Выберите по крайней мере три отступа достопримечательностей на ячейку рядом с его ягодный центр, установить его, чтобы повторить отступ три раза с каждой стороны, а затем нажмите пандус и захвата. В программном обеспечении анализа, откройте файл точки MCA, это показывает положение каждой кривой силы на отсканированном изображении.
Затем откройте одну кривую силы для анализа. Нажмите кнопку коррекции базовой линии и перетащите синие линии тире на кривой силы, пока не начнется линия базы источника и не будет удлинено остановка базовой линии источника, или на 0 процентов и 80 процентов соответственно. Затем нажмите на выполнение.
Затем нажмите кнопку фильтра автомобиля коробки, и нажмите выполнить, чтобы сгладить кривую силы. Затем нажмите кнопку отступа. В окне ввода установите активную кривую для расширения, пятый метод линейной модели, максимальную силу, пригонка границы до 99 процентов, мин силу, пригонка границы до 75 процентов, и подходят модели к жесткости.
Проанализируйте кривые силы в партии. Для достижения этой цели нажмите кнопку истории запуска, укажите каталог отчетов и добавьте другие кривые силы, требующие такого же лечения. Когда закончите, нажмите запустить.
Когда значение для K установлено, нажмите историю и перейдите к пяти отступам, чтобы вернуться в окно отступа. Оказавшись там, изменить максимальную силу подходят границы до десяти процентов и мин силы подходят границы до одного процента. Затем установите подходят модели Герциан.
Затем откройте соответствующий файл для отображения различных отсканированных каналов. В окне высокого канала нажмите на кнопку раздела. Это позволит измерить кривизну поверхности образца, которая необходима для вычета тургорского давления.
Затем нарисуйте линию через длинную ось одной ячейки, перемести границы линии тире к краям ячейки и замитьте значение радиуса. Наконец следуйте вместе в текстовом протоколе, чтобы вычислить модул среднего молодого, пружинная константа, E, K и давление тургора для каждой ячейки. Изображение слева – это карта модула молодого человека, полученная путем анализа всего отступа до определенной пользователем точки набора силы, в то время как изображение справа показывает результат анализа первых ста нанометров отступа.
Здесь две карты выглядят очень похожи, однако, изменение глубины отступа может привести в некоторых случаях, чтобы лучше выделить выборки неоднородности, которые могут быть полезны для определения местоположения или для предоставления информации о поведении внутренних структур. Для каждой точки на этих картах существует базовая кривая силы. Кривая, показанная здесь, имеет два эффекта, которые стоит упомянуть.
Прежде всего, если приближение части кривой силы заканчивается на пятьсот нано ньютонов. Движение нисходящего наконечника продолжается. Это означает, что окончательная сила, применяемая наконечником, выше, чем ожидалось.
Вторая вещь, котор нужно заметить, волна в на кривой втягивать выделенной эллипсом. Такое размахивание может быть индикатором движения образца или вибрирования под действием наконечника и перехода на другой метод фиксации может потребоваться. Используя процедуру, описанную в данной статье, все ключевые параметры для вычета тургорного давления, за исключением толщины клеточной стенки, могут быть извлечены из сканирования AFM и отступов.
Кривая силы глубокого отступа в положении красного креста описывает модуль клеточной стенки молодого и кажущуюся жесткость образца при различных режимах кривой. Фиксация образца имеет решающее значение. В процессе измерения обратите внимание на признаки нестабильности выборки.
Тщательно выберите область с плоской поверхностью, чтобы обеспечить перпендикулярную отступ. После этой процедуры, можно контролировать механические свойства с течением времени и различных условиях. Можно также наложить механические измерения с конфокальные изображения для коррелятивных исследований.
Этот метод прокладывает путь для увязки биомеханики с развитием физиологии и другими биологическими процессами.
