Le proprietà meccaniche delle cellule vegetali sono essenziali per essere prese in considerazione quando si cerca di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo. La microscopia a forza atomica può essere usata per misurare queste proprietà, e seguire il modo in cui cambiano, tra organi, tessuti, tutte le fasi dello sviluppo. I principali vantaggi di questa tecnica, è che non è invasiva, è relativamente rapida e non richiede un trattamento quindi può essere applicata direttamente ai campioni viventi.
Per qualcuno che è nuovo a questa procedura, la sezione cis del campione è davvero critica, quindi assicurati di avere davvero una corretta fissazione meccanica del campione. La dimostrazione visiva di questa procedura, è fondamentale per comprendere meglio la complessità della fissazione del campione, il controllo di qualità degli alimenti e la configurazione della misurazione. A dimostrare la procedura saranno Simone Bovio, ingegnere e Yuchen Long, post doc nel mio laboratorio.
Per iniziare, posizionare un pezzo di nastro a doppia parte al centro di una piastra di petri di cinque centimetri di diametro. Aggiungere un campione di genesium che è stato isolato da un bocciolo di fiori al nastro. Aggiungere rapidamente acqua al piatto fino a quando il campione non è completamente coperto in modo da evitare la disidratazione.
Quindi, posizionare il campione su uno stadio AFM e spostare la testa in modo che sia sopra il campione. Dopo aver calibrato il cantilever, nel software, assicurarsi che il sistema sia in modalità QI, e avvicinarsi al campione con una forza del set point di quindici nano newton. Quindi, impostare una lunghezza Z di quattro micron e impostare l'area di scansione su ottanta per ottanta micron al quadrato con il numero di pixel impostato su quaranta per quaranta.
Quindi vai al pannello delle impostazioni di imaging avanzate e imposta la modalità a velocità costante. Inoltre, impostare estendere la velocità di ingresso della traccia a duecento micron al secondo e la frequenza di campionamento a venticinque kilo hertz. Una volta impostati i parametri, spostare la punta nell'area di interesse del campione.
Verificare che l'area da scansionare sia priva di detriti, individuare una regione il più piatta possibile e innestare, quindi iniziare la scansione e utilizzare la scansione rapida a bassa forza per verificare se il campione si muove. Una volta posizionata un'area di interesse, selezionare un'area 40 per 40-60 Micron al quadrato e aumentare il numero di pixel a due pixel per micron. Successivamente, aumentare il set point a cinquecento nano newton, per ottenere un'indentazione da cento a duecento nanometri.
Diminuire la lunghezza Z a due micron e la velocità del tratto di ingresso di estensione a cento micron al secondo, quindi aumentare la frequenza del campione a cinquanta kilohertz e iniziare a scansionare il campione. Al termine, salvare l'output sia come immagine che come file di dati. Aprire il software di elaborazione dati e caricare il file di dati.
Fare clic sul pulsante usa questa mappa per l'elaborazione batch per utilizzare gli stessi parametri su tutte le curve della mappa, quindi andare a caricare il processo predefinito e selezionare hertz fit. Passare quindi all'operazione della linea di base commutabile e impostare sottrai su offset più inclinazione e X min tra il quaranta e il sessanta per cento. Nella linguetta della posizione verticale della punta, selezionare a tenuta stavola, se si preferisce lavorare su dati non elaborati.
Per selezionare il modello di adattamento appropriato, passare alla scheda adatta all'elasticità e selezionare una delle opzioni in base alla forza di adesione prevista. Se non è presente alcuna adesione o adesione debole, utilizzare la curva di avvicinamento e preferire utilizzare il modello di isnader hertz. In caso di adesione più forte, utilizzare il modello di Dergen Milia Dortoprov o DMD e lavorare su una curva ritardata.
Ora imposta i parametri geometrici della punta in base alla forma nominale della punta. La punta utilizzata in questo esperimento è una punta sferica, con il raggio di quattrocento nanometri. Impostare quindi il rapporto Poisson su 0,5 e selezionare le curve di spostamento.
Aggiungere una seconda routine di adattamento dell'elasticità, facendo clic sull'icona tramite la finestra principale e ripetendo le stesse impostazioni dei parametri. Infine, specificate il rientro desiderato in X min, quindi tenete e applicate a tutti per iterare i passaggi precedenti su tutte le curve della mappa. Salvare i risultati per ottenere un'immagine in un file tsv punto.
Per misurare con rapidi cambi di soluzione, montare un campione in una piastra di Petri, tenendo un piccolo pezzo di masttico adesivo. Sigillare rapidamente lo spazio tra il masttico e la base del campione con colla biocompatibile. Attendere che la colla si solidifichiamo e quindi immergere il campione in un mezzo di coltura di apice liquido, contenente lo 0,1% di miscela di conservazione delle piante.
Dopo aver calibrato il sistema, aprire il software di acquisizione e passare prima alla finestra dei parametri di controllo. Lì impostare la costante di molla sulla costante di molla prodotta dal cantilever o sulla costante di molla determinata. Successivamente, impostare il raggio della punta su quattrocento nanometri, il rapporto poisson campione su 0,5, la linea del campione a centoventotto per garantire un'acquisizione rapida, la velocità di scansione a 0,2 hertz e la dimensione della scansione a un micron.
Quindi vai alla finestra della rampa e imposta la dimensione della rampa su cinque micron, la soglia del trig al massimo e il numero di campioni a quattromilaseicentootto. Con tutti i parametri impostati, avvicinati attentamente al campione manualmente. Quando la sonda è relativamente vicina alla superficie del campione, fare clic su approccio.
Al contatto, aumentare gradualmente le dimensioni della scansione e modificare la velocità di scansione, fino a raggiungere il bilanciamento desiderato senza danneggiare il campione o la punta. Riposizionare la scansione se l'area di misura non è come desiderato. Se soddisfatto, fai clic sul pulsante, punta e scatta, per avviare il punto e sparare alla finestra.
Specificare una directory di salvataggio e un nome di file. Quindi fare clic su rampa sulla scansione successiva per avviare la registrazione. Al termine della scansione, l'interfaccia software verrà reindirizzata alla finestra della rampa.
Fare clic sull'immagine digitalizzata per specificare le posizioni da indentare. Scegli almeno tre punti di indentazione per cella vicino al suo centro bacche, impostalo per ripetere l'indentazione tre volte per lato, quindi fai clic su rampa e cattura. Nel software di analisi, aprire il file MCA punto, questo mostra la posizione di ogni curva di forza sull'immagine digitalizzata.
Quindi aprire una curva di forza da analizzare. Fare clic sul pulsante di correzione della linea di base e trascinare le linee del trattino blu sulla curva di forza, fino a estendere l'inizio della linea di base di origine ed estendere l'arresto della linea di base di origine o rispettivamente allo 0% e all'80%. Quindi fai clic su esegui.
Fare quindi clic sul pulsante del filtro dell'auto della scatola e quindi su Esegui per smussare la curva di forza. Quindi fare clic sul pulsante di rientro. Nella finestra di input, impostate la curva attiva da estendere, il quinto metodo sul modello linearizzato, il limite massimo di adattamento della forza al 99%, il limite di adattamento della forza min al 75% e il modello di adattamento alla rigidità.
Analizzare le curve di forza in un batch. A tale scopo, fare clic sul pulsante Esegui cronologia, specificare la directory dei report e aggiungere altre curve di forza che richiedono lo stesso trattamento. Al termine, fare clic su Esegui.
Quando il valore di K è montato in batch, fare clic sulla cronologia e passare a cinque rientri per tornare alla finestra di rientro. Una volta lì, modificare il limite massimo di adattamento della forza al dieci per cento e il limite di adattamento della forza min all'uno per cento. Quindi impostare il modello di adattamento su Hertzian.
Aprire quindi il file appropriato per visualizzare i diversi canali analizzati. Nella finestra del canale alto fare clic sul pulsante della sezione. Ciò consentirà la misurazione della curvatura della superficie del campione necessaria per la deduzione della pressione del turgore.
Quindi disegnare una linea attraverso l'asse lungo di una cella, spostare i limiti della linea del trattino sui bordi della cella e registrare il valore del raggio. Infine seguire nel protocollo di testo, per calcolare il modulo medio del giovane, la costante di molla, E, K, e la pressione di turgore per ogni cella. L'immagine a sinistra è una mappa del modulo del giovane, ottenuta analizzando l'intera rientrazione fino al set point di forza definito dall'utente mentre l'immagine a destra, mostra il risultato dell'analisi dei primi cento nanometri di indentazione.
Qui, le due mappe sembrano molto simili, tuttavia, la variazione della profondità di indentazione può portare in alcuni casi a evidenziare meglio le eterogeneità del campione, che possono essere utili per identificare la posizione o per fornire informazioni sul comportamento delle strutture interne. Per ogni punto su queste mappe, c'è una curva di forza sottostante. La curva mostrata qui, ha due effetti che vale la pena menzionare.
Prima di tutto, se la parte di avvicinamento della curva di forza termina a cinquecento nano newton. Il movimento verso il basso della punta continua. Ciò significa che la forza finale applicata dalla punta è superiore al previsto.
La seconda cosa da notare è l'onda sulla curva di retrazione evidenziata dall'ellisse. Tale agitazione può essere un indicatore dello spostamento o della vibrazione del campione sotto l'azione della punta e può essere necessario passare a un metodo di fissazione diverso. Utilizzando la procedura documentata in questo articolo, tutti i parametri chiave per una deduzione della pressione del turgore ad eccezione dello spessore della parete cellulare possono essere recuperati da scansioni e rientranze AFM.
La curva di forza dell'indentazione profonda nella posizione della croce rossa descrive il modulo del giovane parete cellulare e l'apparente rigidità del campione a diversi regimi della curva. La fissazione del campione è fondamentale. Durante il processo di misurazione, prestare attenzione ai segni di instabilità del campione.
Scegliete con cura una regione con superficie piana per garantire l'indentazione perpendicolare. Seguendo questa procedura, è possibile monitorare le proprietà meccaniche nel tempo e le diverse condizioni. Si possono anche sovrapporre misure meccaniche con immagini confocali per studi correlativi.
Questa tecnica apre la strada al collegamento della biomeccanica con lo sviluppo della fisiologia e altri processi biologici.
