Рост растительных клеток контролируется механическими свойствами их клеточных стенок. Поэтому важно знать эти свойства в разных органах и тканях растений. Представленный здесь способ позволяет биомеханическую характеристику неподвижных и не обезвоженных клеточных стенок во внутренних тканях молодых растений.
Начните с подготовки растворов и образца для вибратомного сечения. Налейте четырехмиллиметровый слой расплавленной 3%-агарозы на дно чашки Петри и дайте ей немного остыть, чтобы предотвратить термическое повреждение образца. Поместите около пяти миллиметров длиной три или четыре куска растительного органа горизонтально на агарозу.
Примерно через 30-60 секунд на вершине первого слоя агарозы появится тонкая полутвердая пленка. Затем аккуратно насыпьте сверху второй слой. После того, как агароза полностью затвердеет, вырежьте блок, содержащий образец.
Придайте блоку форму шестиугольной усеченной пирамиды, чтобы обеспечить его устойчивость при дальнейшем сечении. Перед началом секционирования образца с помощью вибратома приклейте блок к стадии вибратома с помощью цианоакрилатного клея. Поместите сцену в вибратом, так, чтобы один из углов пирамиды был обращен к лезвию вибратома, и налейте воду в ванну вибратома.
Установите параметры сечения, такие как толщина сечения, скорость лезвия и частота вибрации, и вырежьте образец. Используя тонкую щетку, переместите секцию с водяной бани на стеклянную горку и поместите каплю воды на секцию, чтобы предотвратить ее высыхание. Проверив качество секции под световым микроскопом, выберите соответствующий участок, имеющий клеточную стенку перпендикулярно плоскости сечения.
Затем обездвижите секцию для измерений атомно-силовой микроскопии, налив слой из одного миллилитра 1% расплавленной агарозы на дно крышки чашки Петри с помощью пипетки. После того, как агароза затвердеет, удалите лишнюю воду из секции, поднеся фильтровальную бумагу к ее краю. Аккуратно перенесите срез от слайда к центру крышки чашки Петри с помощью кисти.
Затем осторожно добавьте 1% агарозы вокруг секции с помощью 20-микролитровой пипетки и налейте воду или другой раствор для атомно-силовой микроскопии в крышку чашки Петри с иммобилизованным сечением. Направьте образец под атомно-силовую микроскопическую консоль с помощью оптического микроскопа. Нажмите кнопку «Подход», а затем кнопку «Посадка», чтобы приблизиться к образцу в режиме контакта с заданным значением одного наноампера.
Нажмите кнопку Сканирование, а затем кнопку Область. Выберите площадь 50 микрометров на 50 микрометров для сканирования. Нажмите кнопку «Переместить зонд» и проверьте всю область сканирования, переместив сканер над ней и найдя самую высокую точку в зависимости от степени протрузии сканера.
Откройте вкладку Подход. Затем нажмите кнопку Удалить, чтобы удалить образец. Используя самую высокую точку в качестве цели, нажмите кнопку Landing, чтобы снова приблизиться к образцу.
Затем проверьте поверхность еще раз, нажав на кнопку Move Probe и переместив сканер над ней. Установите скорость сканирования на 0,5 герц и установите размер сканирования на 50 микрометров на 50 микрометров, а точку сканирования на 64 на 64. Нажмите кнопку «Выполнить» и просканируйте, чтобы проверить поверхность образца и возможное загрязнение агарозой.
После нажатия кнопки Вкл., выберите режим HDPlus в выпадающем меню в главном окне программы и установите заданное значение 0.1 наноампер в главном окне программы. В главной вкладке окна HD задайте параметры сканирования, соответствующие исследуемому образцу. Затем откройте вкладку «Шумы» в окне HD и введите резонансную частоту консольного устройства.
Откройте вкладку «Квант» окна HD и введите IOS, консольную жесткость, радиус наконечника и угол. Выберите модель контакта, которая будет использоваться для расчетов в зависимости от геометрии наконечника. После этого откройте вкладку Scan окна HD и выберите сигналы, а также направление, в котором сигнал записывается.
Установите флажок «Громкость усилия», чтобы получить запись всех кривых силы, и нажмите кнопку «Выкл.» в верхней части главного окна программы, чтобы включить петлю обратной связи Нажмите кнопку Phase Core в главном окне HD, чтобы исправить чувствительность оптической системы. Вкладка Versus Time главного окна HD представляет функцию сравнения сигнала DFL со временем в режиме реального времени. Выберите части этой функции, которые будут использоваться для определения базового уровня и для соответствия контактной модели для дальнейших расчетов.
Теперь установите значение точки сканирования 256 на 256 в главном окне программы. Затем установите скорость сканирования на 0,2 герц и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы отсканировать образец. После остановки сканирования нажмите кнопку «Вкл.» в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.
Выберите Режим контакта в раскрывающемся меню, откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Удалить, чтобы отозвать образец. Нажмите кнопку Данные, чтобы открыть программное обеспечение для анализа и сохранить выходные данные. Откройте сохраненный файл в аналитическом программном обеспечении.
Выберите кадр громкости силы HD. Удерживая нажатой клавишу Control, выберите один визуальный кадр, полученный в том же направлении сканирования. Нажмите кнопку Загрузить внешнюю карту, чтобы увидеть, где расположены клеточные стенки.
Проверьте значения InvOptSens и консольной жесткости на главной вкладке. Откройте вкладку Дополнительно и проверьте параметры наконечника и контактную модель. Нажимайте на различные точки на клеточных стенках на визуальном кадре и выбирайте только те кривые, которые хорошо описаны моделью.
Белые области на карте модулей соответствуют ошибочной переоценке модуля Юнга из-за того, что сканер достигает своего предела в направлении Z. Это изображение неудобно использовать в качестве внешней карты для дальнейшего выбора удовлетворительных кривых силы. Однако карта сигналов DFL, представленная справа, здесь лучше подходит.
Различные приборы могут относиться к сигналам DFL как к сигналам отклонения или ошибки. Сканер, который был полностью расширен при попытке достичь нижней части образца, может привести к ошибочным измерениям и даже прерванному сканированию. Наличие агарозы может быть проверено при получении первого сканирования в контактном режиме, так как клеточные стенки и некоторые клеточные днища видны на таких сканированиях.
Однако в случае неточной иммобилизации поверхность может быть покрыта агарозой, которая маскирует топографию образца. Из четырех различных кривых силы, зарегистрированных в разных точках одной и той же клеточной стенки, кривая, зарегистрированная при 0,1, не показывает базовой линии, что означает отсутствие отделения кончика консольной части от клеточной стенки. Кривая, зарегистрированная на уровне 0,3, показывает плечо на приближающейся части, указывающее на изгиб клеточной стенки.
Точки вторая и четвертая показывают удовлетворительные кривые силы с аналогичными значениями модулей. Пробоподготовка и экспертиза требуют практики, но ее можно освоить. Важной частью этого протокола является фильтрация результирующих кривых.
Не полагайтесь на модули, которые были рассчитаны автоматически. Этот же метод может быть использован для измерения сил адгезии или рассеивания энергии. Это также может быть важно для описания вискозного или вязкоупругого поведения некоторых материалов.
