Этот протокол может быть использован для выполнения конвекции расширенной доставки у мелких грызунов с помощью системы шаг катетер для регулируемой равномерной перфузии целевых областей мозга. Преимущество конвекционной доставки заключается в том, что она позволяет доставку веществ в область интересов в обход гемового барьера с небольшим повреждением тканей или рефлюксом. Этот метод в первую очередь полезен для доставки терапевтических веществ, таких как антитела в мозг.
И поэтому может быть использован для целевой многих неврологических заболеваний. Демонстрацией процедуры будет Михал Beffinger, пост-док из моей лаборатории. Начните с разрезания куска сплавленной силика капиллярной трубки с внутренним диаметром 0,1 миллиметра и толщиной стены 0,325 миллиметра до длины 30 миллиметров.
После изучения труб для трещин использовать микрофорж для обогрева концы, чтобы обеспечить трубки отверстия имеют гладкую поверхность. Затем смонтировать 27-калибровочный иглу на 10-литровый шприц и поместить шприц в стереотаксического робота. Используйте робота, чтобы переместить шприц по твердой поверхности и коснуться поверхности кончиком иглы.
После того, как это положение поднять иглу, чтобы размещение сплавленного кремнезема капилляров внутри иглы так, что 20 миллиметров капилляра выступает от иглы. Используйте пипетку, чтобы равномерно распределить два микролитера высокой вязкости цианоакрилата клей над капилляром, начиная с металлической иглы и заканчивая десять миллиметров над нижним концом капилляра. Используйте стереотаксического робота, чтобы опустить металлическую иглу до тех пор, пока кончик иглы не будет на один миллиметр над эталонной поверхностью, чтобы зафиксировать сплавленную капилляр кремнезема в металлической игле, образуя один миллиметр от кончика металлической иглы.
Удалите излишки клея формирования в конце металлической иглы, чтобы избежать посадки катетер шаг. Проверьте наконечник под микроскопом, чтобы подтвердить, что все излишки клея были удалены. Затем подождите 15 минут, пока клей затвердеет и удалите шприц с катетером от робота.
Для испытания степного катетера вырезать затвердеет 0,6%агарозный гель на 20 на 20 миллиметров блоков и вручную заполнить степной катетер шприцем с 10 микролитров фильтрованного 0,4%трипана синего раствора. Используя стереотаксического робота, обойтись один микролитер красителя на 0,2 микролитров в минуту, чтобы оценить уплотнение шага катетера во время процедуры фиксации. Трипан синий раствор должен быть виден исключительно на кончике катетера.
Протрите краситель бумажной тканью и поместите блок агарозы в стереотаксического робота. Калибровать робота сказал, что кончик катетера ссылается на поверхности блока агарозы. Установите пропорциональную последовательность объемов инъекций в соответствии с конкретным экспериментальным планом.
Для введения раствора в мурин caudate putamen, установить инъекцию на один миллиметр фронта и полтора-два миллиметра боковой от положения брегмы на глубине 3,5 миллиметра. Когда игла находится в положении начать конвекцию расширенной процедуры доставки и ввести пять микролитров трипан синий раствор в блок агарозы. Оцените форму трипана синего облака в агарозе и для потенциальной утечки вдоль катетерного тракта.
Никакого крупного обратного потока по кончику металлической иглы быть видимым. После инъекции оставьте катетер на месте в течение двух минут, прежде чем втягивать иглу на один миллиметр в минуту, чтобы обеспечить надлежащее рассеивание жидкости в мозг и уплотнение инъекционного тракта во время удаления. Поместите новый блок агарозы в робота и начните вторую инъекцию одного микролицера на 0,2 микролитров в минуту, чтобы оценить засорение катетера в агарозе.
Трипан синий должен снова образовывать облако от кончика катетера сразу после начала инъекции. Затем оцените, соответствует ли оставшийся объем в шприце 3 микролитерам, так как любые вариации могут свидетельствовать об утечке жидкости через монтаж катетера или шприца. Для инъекции антител в murine striatum подтверждают отсутствие реакции на щепотку кожи в анестезированной мыши и брить голову с триммером волос.
Дезинфицировать кожу ватными тампонами, пропитанными раствором йода. Используйте скальпель, чтобы сделать 10-миллиметровый разрез кожи вдоль черепной средней линии отделки на уровне глаз. Закрепните мышь в стереотаксической раме с помощью зажима носа и ушных прутьев, заботясь о том, чтобы поверхность черепа была горизонтальной и плотно закрепленной.
Поместите шприц в стереотаксического робота и синхронизировать сверло бит с кончиком катетера на точку отсчета. Используйте типсы, чтобы вытянуть кожу и локализовать брегму на поверхности черепа. Справочная брегма в программном обеспечении, используя кончик сверла бит и переместить сверло на один миллиметр фронтальной и два миллиметра боковой от положения брегмы.
Просверлите отверстие заусенца заботя для того чтобы не повредить матер dura и двинуть шприц над отверстием заусенца. Выпределите от 0,5 до одного микролитора из шприца, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха в катетере не остаются. Начало конвекции расширенной доставки, как показано, наблюдая поверхности черепа для любых следов обратного потока жидкости из места инъекции.
В конце доставки и удаления катетера начать инъекцию насоса на 0,2 микролитров в минуту, чтобы проверить на наличие доказательств засорения катетера во время инъекции. Если не засорение произошло капля инъекционной смеси следует немедленно наблюдать исходя из кончика катетера. На этом изображении облако трипан синий формирования после инъекции одного микролитора красителя на 0,5 микролитров в минуту с помощью конвекции расширенного катетера, как попродемонстрировано, не рефлюкс вдоль игольчатого тракта был виден в начале катетера шаг.
И рассеянное облако сформировало нужную сферическую форму. На этом изображении с помощью тупой иглы конца однако, значительный рефлюкс можно было наблюдать. Примечательно, что конвекция расширенной доставки позволяет перфузии больших объемов в мозг мурина в равномерной и менее ткани повреждения образом по сравнению с обычными инъекциями.
В обоих типах родов существует типичный профиль распределения антител и декстрановых частиц по мозоли корпуса. Тем не менее, профиль дисперсии вводили антитела более рассеянным, чем наблюдается для высокого молекулярного веса декстрана после конвекции расширенной доставки, что является примером различий в распределении между различными инфузатами. Как катетер потенциально может засорить во время вливания мозга, важно, чтобы проверить его сразу же после медленно дозирования небольшой объем инфузии.
Эта процедура может служить способом доставки фармакологически активных соединений в мозг и должна сопровождаться тесным мониторингом симптомов заболевания и ожидаемых побочных эффектов. Этот метод позволяет настой точной области мозга с терапии, включая антитела, открывая новые возможности для развития центральной нервной системы целевых методов лечения.
