В этом протоколе подробно рассматривается использование устройства позиционирования для интраназальной доставки биомолекул к мыши ЦНС. Использование этого устройства значительно снижает управляемость мышей и время лечения, что приводит к повышению эффективности и воспроизводимости техники. Чтобы начать эту процедуру, оценить уровень анестезии мышей педаль рефлекс для того, чтобы поддерживать хирургическую плоскость.
Затем поместите устройство позиционирования на соответствующее расстояние и высоту, чтобы обеспечить удобный доступ ко всем необходимым реагентам. Затем нанесите мазь на глаза животного. Ремешок одной мыши с ремнями стула, убедившись, что конечности мыши обеспечивают естественную поддержку в то время как он находится в расслабленном положении без какого-либо дискомфорта.
Повторите процедуры для оставшихся мышей. Аккуратно поместите каждую мышь на назначенный стул, положив спину параллельно спинкам спинки стула и при 90 градусах к стулу сиденья. Пусть животное лежит естественно в голове вниз и вперед позиции без нажатия или нажатия.
После того, как все мыши привязали, немедленно начать интраназальной прививки. Для выполнения интраназальной доставки загрузите микропипюту двумя микролитровами комплексного раствора RVG9R siRNA. Держите пипетки в доминирующей руке и поддержите его с другой стороны, чтобы избежать неконтролируемых движений при введении siRNA.
Поместите около двух капель микролитров очень близко к одной ноздре, так что мышь может непосредственно вдыхать его. Если крошечная капля не легко образуется, замените наконечник пипетки на новый и повторите операцию. Аккуратно нажмите голову мыши вниз указательным пальцем в течение пяти секунд, пока она вдыхает и поддерживать положение.
Для предотвращения дренажа препарата в легкие важно, чтобы богато нажмите голову мыши вниз указательным пальцем в течение пяти секунд, пока мышь вдыхает. Запустите секундомер, чтобы часы три-четыре минуты после этого время прививки во второй нар первой мыши. Этот промежуток времени необходим для мыши, чтобы завершить вдыхание первой дозы и восстановить нормальное дыхание.
В трех-четырехминутный интервал между прививкой альтернативных нарес на первой мыши, полная интраназальная прививка одного нара в каждой из оставшихся трех мышей, размещенных на устройстве. Когда секундомер звучит, привить вторую ноздрю на первой мыши и повторить процедуру для других мышей, как указано выше. Повторите процедуру до тех пор, пока для всех четырех мышей не будут доставлены от 20 до 30 микролитров.
Это займет от 30 до 45 минут, чтобы завершить всю процедуру прививки. Верните животных обратно в назначенные клетки. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не пришли в достаточное сознание для поддержания стернальной лежачих.
Для оценки глушивания генов, извлечения РНК из различных областей мозга с набором очистки РНК, обратной транскрипции в cDNA с помощью комплекта синтеза cDNA, и выполнять qPCR с грунтовки пар. Большинство доставки мозга пептида RVG9R помечены Alexa Fluor 488 был впервые протестирован с помощью мыши позиционирования устройства, описанного здесь. В 48 часов после прививки, различные органы были вырезаны для измерения A488 флуоресценции.
Ни в одном из органов отрицательного контроля ничего не обнаружено. С другой стороны, сильный флуоресцентный сигнал A488 был обнаружен исключительно в мозге привитой группы RVG9R. Кроме того, положение мыши было сравнено с методом положения на спине и методом бодрствования для эффективности.
Результаты показали, что позиционирование мышей голову вниз и вперед улучшилось penetrance и осаждения RVG9R A488 по всей ткани мозга. Для дальнейшего подтверждения доставки siRNA в мозг, полное сканирование мозга было выполнено после одного интраназального введения RVG9R комплекс с Cy5 помечены siRNA. В отличие от PBS или RVM9R, комплексирование с RVG9R привело к сильному накоплению siRNA в основных областях мозга, включая обонятельную лампу, кору, гиппокамп, таламус, гипоталамус, средний мозг и мозжечок.
Устройство позиционирования может быть использовано для доставки лекарств или молекул мыши ЦНС. Приложения распространяются на тестирование терапевтических средств, а также изучение клеточных механизмов в ЦНС. Это устройство позиционирования было использовано следователями для демонстрации потенции siRNAs в лечении болезни вируса Западного Нила, а также изучение методов лечения других заболеваний ЦНС.
