Количественная оценка вируса бешенства в различных структурах мозга крупного рогатого скота. Мексика является страной со значительным потенциалом животноводства. Государства с самым высоким животноводством содержат как влажные тропические регионы, так и сухие регионы, которые находятся под угрозой вспышек бешенства из-за присутствия летучей мыши-вампира, Ротундуса Десмодуса, основного передатчика бешенства.
Обнаружение нуклеопротеина вируса бешенства N в основном используется для диагностики бешенства молекулярными тестами. Используя ПЦР-подходы, минимальное количество инфекционного агента может быть обнаружено в клиническом образце путем селективного и повторяющегося усиления нуклеотидной последовательности ДНК. qRT-PCR основан на обнаружении и количественной оценке молекулы, где увеличение сигнала флуоресценции напрямую пропорционально количеству продукта ПЦР в одной реакции.
По мере увеличения количества копий цели нуклеиновой кислоты увеличивается и флуоресценция. Основываясь на этом, целью исследования было использование количественных qRT-PCR для определения количества вирусных частиц в различных анатомических структурах мозга крупного рогатого скота, после смерти, из-за бешенства инфекции. Всего РНК была извлечена непосредственно из крупного рогатого скота мозга с использованием метода органической экстракции в соответствии со следующим протоколом.
Используйте 100 миллиграммов тканей мозга из каждой анатомической структуры для извлечения общей РНК с использованием коммерчески доступного реагента, содержащего изотиоцианат гуанидиния. Вручную гомогенизировать в общей сложности 100 миллиграммов ткани из каждой структуры в одном миллилитре гуанидиниума изотиоцианат реагент путем вихря с помощью Dounce гомогенизатор с небольшой пестик внутри микротрубки в течение 15 секунд на максимальной скорости. Инкубировать образцы на льду в течение пяти минут, а затем добавить 200 микролитров хлороформа.
Смешайте образцы энергично в течение 15 секунд. Инкубировать на льду в течение двух-трех минут, а затем центрифугу при 12 000 х г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите aqueous фазу в чистую трубку и добавьте 500 микролитров изопропилового спирта.
Инкубировать образцы в течение 15 минут при 21 градусе по Цельсию. Центрифуга образцов на 12 000 х г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Аспирировать aqueaous supernatant путем pipetting.
Изолированная РНК будет присутствовать в виде гранулы в трубке. Затем вымойте гранулы РНК одним миллилитром 75%этанола путем пипетки и центрифуги при 7 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Декант супернатант и воздух высушит гранулы РНК при комнатной температуре, 21 градус по Цельсию.
Затем разбавьте гранулы в 50 микролитров воды без нуклеазы. Определите концентрацию и качество РНК на 260 нанометров с помощью спектрофотометра. Транскрипция in vitro генерирует мРНК гена-мишени.
Используйте грунтовку, которая усиливает полный ген RABV N, и тот, который используется в качестве положительного контроля для анализа qRT-PCR. Эти грунтовки предназначены для усиления полного гена RABV N, а также добавить промоутер, который распознает полимеразы T7. Чтобы усилить весь ген N RABV, используйте грунтовки транс и RAB вперед и 1, и высокая точность PCR комплект.
Для каждой реакции подготовьте мастер-микс ПЦР, добавив к чистому буферу реакции ПЦР трубку с 10 микромоляном каждой грунтовки и 0,5 единицами полимеразы высокой точности. Использовать продукт PCR в качестве шаблона для синтеза in vitro и удаления компонентов энзиматической реакции, очищать продукт PCR с помощью комплекта концентратора на основе столбца, в соответствии с инструкциями производителя. А затем количественно с помощью спектрофотометра.
Для синтеза РНК используйте набор для транскрипции in vitro со следующей реакционной смесью: пять микролитров T7 транскрипции 5X буфера, 1,9 микролитров каждого трифосфата нуклеотида, 10 микрограммов очищенной RABV N DNA и 2,5 микролитера ферментной смеси. Затем инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Затем добавьте один микролитер по одному блоку на микрограмм Rnase-Free DNase в реакционной смеси и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию для устранения загрязнения ДНК.
Очистить в пробирке транскрибированной РНК, а затем сконцентрировать его с помощью фенола:хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1. Перепродюснйте очищенные гранулы РНК в 70 микролитров буфера TE, а затем храните его на 80 градусов по Цельсию до его использования. Повторите протокол ПЦР до получения примерно пяти микрограммов продукта ПЦР.
После очистки и концентрации транскрибированная в пробирке N ген мРНК будет присутствовать при концентрации 4,711 микрограмма на микролитер. Подтвердите, что транскрибированная мРНК in vitro соответствует гену N после следующего шага 5 этого протокола, и используйте это в качестве положительного контроля для обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени, qRT-PCR. Для обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в режиме реального времени используйте транскрипт in vitro mRNA при кодировании полного гена N в качестве положительного контроля.
Наряду с коммерческим одношаговым комплектом qRT-PCR, используя гибридизационые зонды в соответствии с инструкциями производителя. Используйте зонд в праймерах, описанных Коронадо и коллегой 2010 года, чтобы обнаружить сохраненную область RABV, используя следующие условия теплового велоспорта. Выполняем серийные разбавления транскрибированной мРНК in vitro, последовательно протупляя один микрограмм на микролитер мРНК в трубки до тех пор, пока не будут получены шесть разбавлений.
Подготовка труб на 100 микролитер объем в триликат для использования в создании стандартной кривой. Выполните qRT-PCR, как описано ранее. Выполняйте qRT-PCR в тепловом циклере с ротором, обрабатывая различные образцы мозга одновременно с ходовых реакциями для создания стандартной кривой и используя положительный контроль, отрицательный контроль и супернатанты, изолированные от клеточной культуры.
Чтобы оценить предел обнаружения, эффективность теста и чувствительность теста, используйте стандартную кривую в тройном режиме при тех же условиях. Для обнаружения гена N RABV используйте РНК из полевых образцов, положительный контроль, отрицательный контроль и супернатанты клеточной культуры для выполнения qRT-PCR с использованием описанного ранее набора ПЦР. Для определения количества копий генома RABV, присутствующих в образцах мозга крупного рогатого скота, получить данные КТ из стандартной кривой и биологических образцов, а также из тех, интерполированных из уравнения кривой калибровки Эта цифра показывает бычьих тканей мозга, проявляли положительное окрашивание в соответствии с прямым иммунофлюоресценцией.
Результаты показывают 100%100%83.3%66%и 50%положительность для RABV в коре головного мозга, таламусе, medulla, pons, и рожочках соответственно. Эти результаты подтверждают предыдущие результаты, и по крайней мере три структуры, расчлененные из каждого мозга, были положительными для RABV. С другой стороны, уравнение стандартной кривой показывает связь между количеством генетического содержания RABV в образце и размером утяненного фрагмента ПЦР.
Количество генетического содержания RABV в нанограммах было выведено путем интерполяции значений КТ в кривой калибровки с использованием уравнения, представленного на этой цифре. Используя это уравнение, было установлено, что предел обнаружения от одного раза от 10 до пятого микрограмма на микролитер вирусной РНК соответствует 36 копиям генома RABV. Эти результаты показывают, что анализ чувствителен и может быть использован для обнаружения вируса в образцах, которые содержат небольшое количество копий гена RABV N.
Эффективность анализа была рассчитана с помощью наклона стандартной кривой, которая составила 3,28. Образцы, используемые для qRT-PCR, показали усиление гена RABV N. Для определения количества присутствующих вирусных копий значения КТ для каждого образца были интерполированы с помощью уравнения кривой калибровки.
Результаты, полученные в нанограммах, были заменены в формулу, описанную здесь. В этой таблице показаны сравнительные результаты между qRT-PCR и DFA. Результаты анализа qRT-PCR соответствовали результатам, полученным с помощью DFA.
Согласно результатам, полученным в тесте qRT-PCR в случаях C и D, таламус является структурой, которая обладает наибольшим количеством копий гена RABV N. Это говорит о том, что ранняя инфекция гипоталамические и таламические нейроны имеет важное значение в развитии болезни, учитывая, что эти нейроны контролируют вегетативные функции животного. Копии генов RABV N, которые были обнаружены в каждой структуре каждого образца: чувствительность и специфичность теста qRT-PCR мы оба 100%, как и все образцы были положительными.
Этот результат согласуется с первоначальными диагнозами образцов. qRT-PCR является очень чувствительным методом. Некоторые из этих шагов имеют решающее значение для получения наилучших результатов.
Одним из них является надлежащее обращение с образцами для извлечения РНК. Этот шаг имеет решающее значение, поскольку РНК легко деградирует, и поэтому результаты могут быть затронуты. Рассмотрим поддержание образца в холодных условиях, примерно четыре градуса по Цельсию во время процесса.
Кроме того, учти, что несколько раундов применения ПЦР проводятся, как увеся в транскрипции in vitro. Анализ qRT-PCR, проведенный в этом исследовании, мог обнаружить всего 36,3 копии гена RABV N на миллиграмм ткани. Наиболее подходящими структурами мозга для qRT-PCR были кора и таламус.
Это основано на наблюдениях, что более высокие концентрации гена RABV N были обнаружены в этих структурах, и что они также были найдены, чтобы быть положительными с помощью справочного теста RABV. Тест был в состоянии обнаружить очень низкие концентрации, 0,00023 раза от 10 до девятого экземпляров вируса в различных образцах. В дополнение к количественной оценке вирусных частиц в образце, тест, как представляется, обеспечивает хороший альтернативный диагностический и исследовательский инструмент для обнаружения RABV представлены здесь.
