Инозитол фосфат и фосфаты являются метаболитами, которые имеют несколько регулятивных функций в эукариот, в том числе контроль экспрессии генов, торговли белками, трансдукции сигналов и развития клеток. Они выполняют эти регулятивные функции, связываясь с белками, тем самым изменяя конформацию белка, каталитической активности или белковых взаимодействий. Выявление белков, которые связываются с инозитол фосфат или фосфаты имеет важное значение для понимания того, как эти метаболиты выполняют свою регулятивную функцию.
Этот протокол имеет простой рабочий процесс, который чувствителен, нерадиоактивен, липосом бесплатно и использует реагенты, которые являются коммерчески доступными. В этом методе, законченная хроматография с биотинилированным инозитол фосфатом или фосфатамитидами, использована для того чтобы изолировать взаимодействуя протеины, они после этого определены западным пятном, или спектрометрией массы. Для форм кровотока, расти T.brucei клеток до середины фазы журнала в HMI-9 средств массовой информации, дополняется 10%FBS, при 37 градусов по Цельсию, с 5%Carbon Dioxide.
Держите плотность клеток между 800 000 и 1,6 миллиона клеток на миллилитр. Когда он будет готов, центрифуга клетки в 1600 раз G, и при комнатной температуре в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и аккуратно повторно помеская гранулы в 10 миллилетах PBS-G предварительно нагретых при 37 градусах по Цельсию для мытья клеток.
Центрифуга клетки в 1600 раз G и при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы завершить стирку. Повторите эту процедуру стирки в два раза больше. Затем повторное распределение гранул в один миллилитр PBS-G.
Перенесите эту подвеску в одну точку пятимилитровую трубку, затем центрифугу при 1600 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно посовестите гранулы в нулевой точке пять миллилитров буфера лиза, дополненные одной точкой пять X ингибитор ингибитора X, и один X ингибитор фосфатазы коктейль, который был предварительно охлажден на льду, чтобы подлизить клетки. Центрифуга лисировать при 1400 раз G и при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут.
После этого соберите супернатант, который содержит извлеченные протеины паразита, в новую одну точку 5 миллилитровую пробку для связывающих анализов. Отложите 5% от общего количества лисата для анализа западных помарк. Соберите 50 микролитров инозитол фосфатов или фосфатов, конъюгированных в агарозные бусины, и добавьте в них 500 миллилитров связывающего буфера.
Центрифуга при 1000 Г в течение одной минуты. Откажитесь от супернатанта и хвойте в 50 микролитров связывающего буфера, чтобы уравночные бусы. Используйте несопрягие бусы в качестве контроля, и использовать бисер с различными конфигурациями фосфатов, включая не фосфорилированные формы, для контроля для неспецифических взаимодействий.
Затем добавьте 50 микролитров IP или PI шариков в лизат клетки или очищенные белки. Держите объем бисера в пределах 10% от общего количества лисата. При необходимости используйте связывающий буфер для регулировки объема реакции связывания.
Инкубировать реакцию в течение одного часа или на ночь при четырех градусах по Цельсию, в то время как вращающиеся на 50rpm. После этого центрифугу смешивают при 1000 Г, а при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты. Удалите супернатант, и держать гранулы, убедившись, что держать 5% от supernatant для западного анализа помарки.
Затем добавьте один миллилитр стирального буфера и нажмите или закружить трубку, чтобы повторно использовать смолу. Центрифуга реакции в 1000 раз G, и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты, и отказаться от супернатанта. Повторите этот процесс в общей сложности пять моет.
После этого добавьте в бисер 50 микролитров буфера 2X Laemmli, дополненных 710 миллимолярной 2-меркаптоэтанол. Нажмите или вихрь, чтобы смешать, и разбавить белки. Далее, тепло при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и центрифуга на 10000 раз G в течение одной минуты.
Соберите супернатант и либо заморозьте элуат при температуре минус 80 градусов по Цельсию, либо приступайте к анализу западной помарки. Представленный здесь метод используется для анализа связывания ИП репрессорно-активаторным белком 1 из лизата T.brucei или рекомбинантным белком T.brucei-репрессором-активатором 1 белка. Поскольку RAP1 не имеет канонических доменов связывания PI, связывающие анализы выполняются с ИП, которые не фосфорилированы, или которые фосфорилированы в разных положениях кольца инозитол, и с несопряганными бусинами агарозы.
Западный анализ показывает, что RAP1 преимущественно связывается с бисером PI(3, 4, 5)P3, но также в меньшей степени связывается с бисером PI (4, 5)P2. Тем не менее, он не привязывается к любым другим ИП или агарозы бисера. Чтобы проверить, связывается ли RAP1 непосредственно с ИП, C терминально помеченный рекомбинантный белок RAP1 6XHis выражается и очищается от однородности от E.Coli.
Западные blotting показывает, что увеличение концентрации PI (3, 4, 5)P3, но не PI (4, 5)P2, препятствует взаимодействию рекомбинантных RAP1 с PI(3, 4, 5)P3 шариков. Добавление T.brucei очищенного фермента PIP5Pase к реакции восстановлено PI(3, 4, 5)P3 связывания рекомбинантным RAP1. Это связано с PIP5Pase дефосфорилирования свободного PI(3, 4, 5)P3, и, таким образом, указывает на то, что фосфорилирование шаблон этого метаболита имеет важное значение для нашего RAP1 связывания.
Белки T.brucei, которые связываются с Ins(1, 4, 5)P3, затем идентифицируются по хроматографии сродства с последующим масс-спектрометрией. Анализ SDS-PAGE показывает обогащение белков, выхлытых из бусин Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с белками, вымытыми из бусинок агарозы. Масс-спектрометрический анализ эластимовых белков выявил более 250 белков, из которых 84 были обогащены бисером Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с контрольными бусинами.
Обогащение белков, связанных с Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с контрольными бусинами, коррелирует с белковым сигналом, обнаруженным SDS-PAGE. Важным шагом в этом протоколе является использование соответствующих элементов управления для дискриминации конкретных от неспецифических взаимодействий. Мы рекомендуем использовать несопрягие бусы агарозы, а также бисер, спрягаемый с инозитол фосфатами или фосфатами, используя различные конфигурации фосфатов, в том числе не фосфорилированные формы.
Этот метод может быть применен к другим одноклеточным простейшим паразитам, таким как Трипаносома крузи, лейшмания или плазмодий. Он также может быть легко адаптирован к другим организмам, в том числе дрожжей или клеток млекопитающих. Этот метод может быть соединен с количественной масс-спектрометрией, такой как SILAC, для выявления динамических взаимодействий белков с инозитол фосфатами или фосфатами.
В также может быть объединена с субклеточной фракциотации, для выявления органеллы конкретных белков, которые связываются с этими метаболитами. Этот подход помог определить белки, которые связываются с инозитол фосфатами и фосфатами в T.brucei, клетках млекопитающих и дрожжах. Это помогло определить новые белковые домены, которые связываются с фосфоинозитидами.
Это проложило путь к понимание регулятивной функции этих метаболитов, их роли в экспрессии генов, развитии клеток и трансдукции сигнала в эукариотах. Некоторые из реагентов в этом протоколе являются токсичными или легковоспламеняющимися. Используйте средства индивидуальной защиты, и при необходимости, работа в дымовой капот.
