Модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, и линии первичных клеток становятся неотъемлемой частью разработки лекарственных препаратов, а также инициирования и прогрессирования исследований в области биологии опухолей. Модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, сохраняют гистологический вид раковых клеток, сохраняют внутриопухолевую неоднородность и лучше отражают соответствующие человеческие компоненты микроокноронности опухоли. Его модели для более точных представлений рака человека, то традиционные линии раковых клеток и имеют потенциал для улучшения доклинковой оценки новых противораковых методов лечения.
Кроме того, эти модели могут быть полезны при сравнении молекулярных характеристик или опухолевых подписей между различными подгруппами онкологических больных. NSG мышей рекомендуется в качестве иммунодефицитной модели мыши. Из-за тяжелого иммунодефицита мышей, стерильность должна поддерживаться во всех экспериментах.
В стерильных условиях используйте типсы и ножницы, чтобы тщательно вскрыть опухолевые ткани и обрезать их на несколько мелких кусочков. После анестезии мыши используйте стерильные ножницы, чтобы сделать разрез на один сантиметр на обоих спинных флангах. Используйте стерильные типсы, чтобы нарушить подкожной ткани.
Затем зарезать кусок опухолевой ткани, и поместить его в глубокий участок. Закройте область имплантата подкожным швом хирургическими швами. Стерилизовать рану йодом.
После этого аккуратно поместите мышей в пустую клетку, сохраняя при этом стерна лежа. Обратите пристальное внимание на мышей, как они должны проснуться и начать ходить примерно через три-четыре минуты. Поместите мышей, перенес которые перенесли операцию в новой клетке, отделенной от тех, кто не подвергается операции.
Оцените размер опухоли путем пальпации места имплантации и измеряйте их с помощью калипера Vernier два раза в неделю. После усыплять мышей, используйте стерильные типсы и ножницы, чтобы медленно изолировать опухоль от мышей. Вымойте опухолевые ткани в DPBS в 10-сантиметровой тарелке.
Вы force и ножницы, чтобы вскрыть и удалить некротические области, жировой ткани, сгустки крови и соединительной ткани. Затем используйте форму, чтобы сократить опухолевые ткани до максимальной толщины одного миллиметра. Вымойте ломтики опухоли с DPBS в 10 сантиметров блюдо.
Чтобы начать процесс витрификации, используйте типсы для передачи ломтиков в трубку V1 и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение четырех минут. Ролл и инвертировать трубку кратко и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение еще четырех минут. Затем налейте раствор V1 и нарежьте в 10-сантиметровую тарелку и используйте типсы для переноса ломтиков в трубку V2. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение четырех минут.
Ролл и инвертировать трубку кратко и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение еще четырех минут. После этого налейте раствор V2 и ломтики в 10-сантиметровую тарелку. Перенесите ломтики в трубку V3 и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Ролл и инвертировать трубку кратко и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение еще пяти минут. Убедитесь, что все ломтики опускаются на дно трубки. Если несколько ломтиков остаются плавающими, рулон и инвертировать трубку кратко и инкубировать при четырех градусах по Цельсию, пока все ломтики раковина полностью.
Затем налейте раствор V3 и нарежьте в 10-сантиметровую тарелку. Вырезать держатели ткани до надлежащей длины и поместить их на стерильную марлю. Перенесите ломтики на держатели.
Оберните держатели марлей. Используя типсы, поместите держатели в жидкий азот и дайте им инкубировать в течение пяти минут. После этого наклеить криогенные флаконы с информацией о тканях.
Перенесите держатели с ломтиками тканей во флаконы, которые будут храниться в жидком азоте. Во-первых, переутомить образцы рака желудка из повторно отобранных образцов или собранных тканей PDX. Поместите ткани на лед и перенесите их в 10-сантиметровое стерильное культурное блюдо.
Используйте типсы и ножницы для удаления некротических областей, жировой ткани, сгустков крови и соединительной ткани. Вымойте опухолевые ткани один раз с DPBS содержащие пенициллин и стрептомицин в 10 сантиметров блюдо. Затем разрежьте опухоль на кусочки на крышке блюда.
Максимальная толщина каждого куска должна быть один миллиметр. Перенесите кусочки в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую семь миллилитров коллагеназы типа 1 и трипсина. Vortex смесь кратко.
Инкубировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30 до 40 минут, убедившись, что вихрь смеси каждые пять минут. После этого добавьте равный объем rpMI-1640 среды, дополненной 10%FBS и вихрем смеси тщательно. Перенесите эту смесь в новую 50-миллилитровую центрифугу путем медленной фильтрации через 40-миллиметровый фильтр.
Центрифугировать фильтраты со скоростью от 113 до 163 раз г в течение пяти-семи минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите этот супернатант. Вымойте гранулы с пятью миллилитров PBS и тщательно удалить супернатант.
Если гранулы красные, он содержит эритроциты. Аккуратно повторно подперст гранулы с 500 микролитров буфера лиза красных кровяных телец и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте пять миллилитров PBS.
Центрифуга на скорости от 113 до 163 раз г в течение пяти-семи минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно нанесите гранулы со средой культуры и перенесите смесь в стерильное 10-сантиметровое блюдо. Инкубировать культуру на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа, убедившись, что заменить среды с сывороткой, содержащей среды каждые два-три дня.
В этом исследовании, рак желудка PDX модели и первичных клеточных линий установлены. Опухоли первого поколения, как видно, растут медленнее, чем в более поздних поколениях, принимая три недели или больше, чтобы достичь соответствующего размера. Успешность формирования подкожной опухоли первого поколения составляет более 80%Идентификация раковых клеток из моделей PDX подтверждается моделями PDX путем окрашивания H и E.
Успешное образование опухоли из криоконсервированных опухолевых тканей, как видно, составляет примерно 95%Опухолевые клетки могут быть легко распознаются различиями в морфологии. Первичные клетки под микроскопом самостоятельно аутентичены двумя патологоанатомами. Для дальнейшего подтверждения, Н И Е окрашивание используется для наблюдения морфологии раковых клеток после фиксации.
Скорость успешной изоляции первичных клеточных линий составляет около 40%Эти модели, как было показано, прогностические клинических исходов и используются для доклинической оценки наркотиков маркерной идентификации, биологических исследований и персонализированных стратегий медицины.
