В лигноцеллюлосной биомассе активность ферментов, анализирующих полисахариды, ограничена наличием неспецифических взаимодействий с лигнином. Анализ FRET является актуальным подходом к эволюции в наномасштабе. Получение всех разделов после может быть проблемой в зависимости от биомассы.
Не то время, делая раздел с микротомой и выполнять нежные стирки. Сопоставление флуоресцентных измерений продолжительности жизни и спектра позволяет количественно чувствительное и недвусмысленное определение FRET между молекулами лигнина и TAG на месте. Этот метод использует сложные методы, такие как выборка разделов на многомерной микроскопии приобретения и анализа, которые могут быть легко узнать с визуальной демонстрации.
Для подготовки образцов растений из дерева, пшеницы, волокон или фрагментов используйте лезвия бритвы, чтобы вырезать один сантиметр длинных образцов, не повреждая структуру материала и поместить образцы под вакуум, чтобы удалить любой воздух. Погрузив образцы в течение 24 часов в последовательных 30%и 50% концентраций ПЕГ, разбавленных в воде при комнатной температуре с нежным перемешиванием. Затем в течение 24 часов погружается в 100%-ную концентрацию ПЕГ при 70 градусах по Цельсию.
После 100%-ного погружения PEG поместите образцы в капсулы на 70-градусную по Цельсию и постепенно уменьшаем температуру пластины на пять градусов по Цельсию, пока пластина не достигнет комнатной температуры. Когда образцы остыли, используйте микротом и одноразовые лезвия, чтобы тщательно получить плоские участки толщиной от 30 до 60 микрометров от каждого блока PEG. Удалите ПЭГ из секций с тремя пятиминутными нежными промывки воды.
После последней стирки инкубировать до трех секций на трубку с 500 микролитров свежеприготовленного флуоресцентного зонда в течение 72 часов защищены от света. В конце инкубации окрашивания используйте кисть для переноса секций на слайд перед монтажом секций между стеклянной горкой и крышкой номер 1.5H. Чтобы определить ширину спектрального окна детектора sFLIM, поместите кристаллы мочевины в культурную коробку с дном стекла 0,17 микрометра и поместите коробку на держатель образца микроскопа.
Выберите цель 20X и титановый сапфировый лазер с длиной волны 900 нанометров и мощностью 2% и включите сканирование. Для выполнения измерений sFLIM переключитесь на режим sFLIM. Чтобы собрать второй гармонический сигнал на детекторе sFLIM, постепенно отрегулируйте длину волны лазерного возбуждения с 900 до 980 нанометров до тех пор, пока второй гармонический сигнал не будет собран во втором спектральном канале.
Затем определите длину спектрального окна. Переключитесь в не отсканированный режим для отправки флуоресцентных фотонов на детектор sFLIM. Установите приобретение sFLIM в режим включения, чтобы позволить фотону рассчитывать на единый фотон счетчик.
Когда прибор будет готов, поместите контроль родной пшеничной соломы только растительный раздел между слайдом и крышкой скольжения на стадии микроскопа и установить систему в непрерывный режим, чтобы лазерное сканирование. Установите 30-секундный сбор времени и убедитесь, что постоянная дискриминатор фракций составляет от одного раза 10 до четвертого и один раз от 10 до шестого. Затем выберите область измерения на примере и нажмите Кнопку «Начало».
В конце измерения сохраните файл sdt и повторите измерение, по крайней мере, еще для девяти образцов. Необходимо найти баланс между достижением достаточного количества собранных фотонов для фотона, избегая при этом скупить пульс, и индуцированными фото эффектами, которые могут изменить срок службы флорескции. Топ анализировать приобретенные данные sFLIM, импортировать родной пшеницы соломы только файлы данных в одном фотоне счетчик программного обеспечения и открыть вариант и режим, чтобы выбрать неполный Multi Exponential 12,5 наносекунд.
В соответствии с опциями и предпочтениями, выберите вычислить инструментальный ответ автоматически и выбрать экспоненциальную модель Fit. Для каждого канала примените подходящую модель и сохраните подходящие параметры в электронной таблице. Для сравнения каналов и экспериментов вычисляйте основную продолжительность жизни флуоресценции в электронной таблице.
Чтобы рассчитать средний срок службы по крайней мере 10 образцов во всех каналах, проанализируйте основной флуоресцентный срок службы на донорских каналах, чтобы определить выделенное значение канала, которое выбрало наибольшее число фотона и соответствует максимальному выбросу лигнина. Для сравнения значений sFLIM и EFRET между контрольным образцом родной пшеничной соломы и экспериментальным образцом рассмотрим положительный EFRET, связанный с однородным уменьшением продолжительности жизни между контролем и экспериментальными образцами, которые будут проанализированы как событие FRET. В этом репрезентативном эксперименте кривые sFLIM показывают некоторые изменения, которые могут быть достигнуты между эталонным образцом и двумя случаями взаимодействия.
Действительно, увеличение флуоресценции в спектральных регионах, соответствующих диапазону выбросов родамина, легко визуализируется. Тщательное наблюдение за тремя кривыми распада первого канала, также показывает более сильный перегиб для родной пшеничной соломы с Декстрин помечены родамин, чем для родной пшеничной соломы инкубируется с PEG помечены родамина. После установки кривых распада фотона и расчета основного времени жизни каждого канала флуоресценции, подпись FRET становится более очевидной.
Например, в то время как время жизни флуоресценции альтернативно увеличивается и уменьшается вдоль спектра флуоресценции для родного образца пшеничной соломы, четкая подпись FRET наблюдается как для местных разделов пшеничной соломы, инкубированных PEG, помеченных роданом и родной пшеничной соломой с Декстрином, помеченным образцами родана. В контексте ингноцеллюлозного гидролиза биомассы этот метод можно легко перенести на исследования ферментного взаимодействия в различных образцах биомассы, требующих строгой характеристики каждой новой биомассы. Так как sFLIM не требует фиксации образца, он прокладывает путь для динамических исследований взаимодействия фермента лигнина и, вероятно, будет направлять стратегии ферментной инженерии и предварительное лечение биомассы.
Как и в большинстве случаев, измерения времени жизни требуют использования импульсных инфракрасных лазерных источников. Соответствующие меры предосторожности должны быть приняты соответствующим образом.
