في الكتلة الحيوية lignocellulosic يقتصر نشاط الإنزيمات تحليل السكريات بسبب وجود تفاعلات غير محددة مع اللجنين. تحليل فريت هو نهج ذو صلة للتطور على نطاق النانو. يمكن الحصول على جميع الأقسام بعد أن يكون تحديا اعتمادا على الكتلة الحيوية.
خذ وقتك في القيام بالقطع مع microtome وأداء الغسيل لطيف. يسمح تجميع قياسات عمر الفلورسنت والطيف بتحديد فريد من الحساسية الكمية لا لبس فيه بين جزيئات اللجنين و 100 في الموقع. تستخدم هذه الطريقة استخدام تقنيات صعبة ، مثل تقسيم العينات على اقتناء المجهر متعدد الأبعاد والتحليل الذي يمكن أن يكون من السهل تعلمه مع العرض التوضيحي البصري.
لإعداد عينات نباتية من الخشب والقمح والألياف، أو شظايا استخدام شفرات الحلاقة لقطع عينات سنتيمتر واحد طويلة دون الإضرار هيكل المواد ووضع العينات تحت فراغ لإزالة أي الهواء. غمر العينات لمدة 24 ساعة في تركيزات متتالية 30٪ و 50٪ من PEG المخففة في الماء في درجة حرارة الغرفة مع التحريك اللطيف. تليها 24 ساعة مغمورة في تركيز 100٪ من الربط عند 70 درجة مئوية.
بعد غمر 100٪ PEG، ضع العينات في كبسولات على 70 درجة مئوية والساخنة خفض درجة حرارة لوحة تدريجيا في خمس درجات مئوية الزيادات حتى تصل لوحة درجة حرارة الغرفة. عندما تكون العينات قد بردت، واستخدام microtome والشفرات المتاح للحصول بعناية شقة 30 إلى 60 ميكرومتر سميكة أجزاء من كل كتلة ال PEG. إزالة الربط من المقاطع مع ثلاثة خمس دقائق يغسل المياه لطيف.
بعد الغسيل الأخير، احتضان ما يصل إلى ثلاثة أقسام لكل أنبوب مع 500 ميكرولترات من مسبار الفلورسنت الطازجة لمدة 72 ساعة محمية من الضوء. في نهاية احتضان البقعة، استخدم فرشاة لنقل المقاطع إلى شريحة قبل تركيب المقاطع بين شريحة زجاجية وزلة غلاف رقم 1.5H. لتحديد عرض النافذة الطيفية للكشف عن sFLIM، ضع بلورات اليوريا في مربع ثقافة مع 0.17 ميكرومتر الزجاج القاع ووضع مربع على حامل عينة المجهر.
حدد الهدف 20X و التيتانيوم استنزفت الياقوت الليزر مع طول موجة نانومتر 900 و 2٪ والسلطة وتشغيل المسح الضوئي. لتنفيذ قياسات sFLIM، قم بالتبديل إلى وضع sFLIM. لجمع الإشارة التوافقية الثانية على كاشف sFLIM ، قم بضبط الطول الموجي لإثارة الليزر تدريجياً من 900 إلى 980 نانومتر حتى يتم جمع الإشارة التوافقية الثانية في القناة الطيفية الثانية.
ثم تحديد طول النافذة الطيفية. قم بالتبديل إلى الوضع الممسوح ضوئيًا غير الـغير لإرسال فوتونات الفلورسنت إلى جهاز الكشف sFLIM. تعيين الاكتساب sFLIM إلى وضع تمكين للسماح الفوتون العد على عداد فوتون واحد.
عندما يكون الجهاز جاهزًا، ضع قش القمح الأصلي للتحكم في قسم النبات وحده بين الشريحة والغطاء ينزلق على مرحلة المجهر، ثم قم بتعيين النظام إلى الوضع المستمر للسماح بإجراء المسح الضوئي بالليزر. تعيين جمع مرة ثانية 30 وتحقق من أن الكسر الثابت تمييز بين مرة واحدة 10 إلى الرابعة و 10 مرات واحدة إلى السادس. ثم حدد منطقة القياس في العينة وانقر فوق ابدأ.
في نهاية القياس، حفظ ملف sdt وتكرار القياس لتسع عينات أخرى على الأقل. يجب إيجاد توازن بين تحقيق ما يكفي من الفوتونات التي تم جمعها للفوتون مع تجنب شراء النبض والتأثيرات التي يسببها الصورة التي يمكن أن تغير عمر الفلوريس. أعلى تحليل البيانات المكتسبة sFLIM ، استيراد القش القمح الأصلي وحده ملفات البيانات في برنامج واحد عداد الفوتون وفتح الخيار ووضع لتحديد غير مكتملة 12.5 نانو ثانية أضعاف الأسية.
ضمن خيارات وتفضيلات، حدد حساب الاستجابة الآلية تلقائيًا وحدد طراز الاحتواء الأسي. لكل قناة، قم بتطبيق نموذج التركيب واحفظ معلمات الملاءمة على جدول بيانات. لإجراء مقارنة بين القنوات والتجارب، قم بحساب عمر الفلورسينسي الرئيسي في جدول البيانات.
لحساب متوسط العمر لما لا يقل عن 10 عينات في جميع القنوات، وتحليل عمر الفلورسنت الرئيسي على القنوات المانحة لتحديد قيمة القناة المخصصة التي اختارت أعلى عدد فوتوني ويتوافق مع الحد الأقصى للانبعاثات lignin. لمقارنة قيم sFLIM وEFRET بين عينة من قش القمح الأصلي للتحكم وعينة تجريبية، فكر في EFRET إيجابية مرتبطة بانخفاض عمر متجانس بين عنصر التحكم والعينات التجريبية ليتم تحليلها كحدث فريت. في هذه التجربة التمثيلية، تظهر منحنيات sFLIM بعض التعديلات التي يمكن تحقيقها بين العينة المرجعية وحالات التفاعل اثنين.
والواقع أن الزيادة في الفلور في المناطق الطيفية المقابلة لنطاق انبعاثات رودامين يمكن تصورها بسهولة. المراقبة الدقيقة من ثلاثة قناة الأولى منحنيات تسوس الفوتون، ويكشف أيضا عن انقلاب أقوى لقش القمح الأصلي مع Dextrin الموسومة مع رودامين، من لقش القمح الأصلي المحتضنة مع PEG الموسومة مع رودامين. بعد تركيب منحنيات اضمحلال الفوتون وحساب كل قناة عمر الفلورانس الرئيسي، يصبح توقيع FRET أكثر وضوحًا.
على سبيل المثال، في حين أن الوقت الحياة الفلوريسنس بدلا من ذلك يزيد وينخفض على طول الطيف الفلوريسنس لعينة من قش القمح الأصلي، ويلاحظ توقيع فريت واضح لكلا من القش الأصلي أقسام القش مع PEG الموسومة مع Rhodamine وقش القمح الأصلي مع Dextrin الموسومة مع عينات Rhodamine. وفي سياق التحلل المائي للكتلة الحيوية، يمكن بسهولة نقل هذه الطريقة إلى دراسات تفاعل الإنزيم في عينات الكتلة الحيوية المختلفة التي تتطلب توصيفاً دقيقاً لكل كتلة حيوية جديدة. منذ sFLIM لا يتطلب تثبيت العينة أنه يمهد الطريق لدراسات التفاعل الإنزيم lignin دينامية ومن المرجح أن توجه استراتيجيات الهندسة الانزيم والكتلة الحيوية قبل المعالجة.
كما معظم الوقت، تتطلب قياسات وقت الحياة استخدام مصادر الليزر تحت الحمراء نبض. ويجب اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة وفقا لذلك.
