리그노셀룰로오스 바이오매스에서 다당류를 분석하는 효소의 활성은 리그닌과의 비특이적 상호작용의 존재에 의해 제한된다. FRET 분석은 나노 스케일에서 진화에 대한 관련 접근법이다. 이후 모든 섹션을 얻는 것은 바이오 매스에 따라 도전이 될 수 있습니다.
마이크로토메로 절제작업을 하고 부드러운 세척을 수행하십시오. 형광 수명과 스펙트럼 측정을 콜라주하면 현장에서 리그닌과 TAG 분자 간의 정량적 민감하고 명확한 FRET 측정을 할 수 있습니다. 이 방법은 시각적 데모로 쉽게 배울 수 있는 다차원 현미경 수집 및 분석에 대한 샘플 단면화와 같은 까다로운 기술의 사용을 사용합니다.
목재, 밀, 섬유 또는 파편에서 식물 샘플을 준비하려면 면도날을 사용하여 재료의 구조를 손상시키지 않고 1센티미터 길이의 샘플을 절단하고 샘플을 진공 아래에 배치하여 공기를 제거합니다. 샘플을 24시간 동안 연속30%와 50% 농도로 실내 온도에서 부드러운 교반으로 물에 담급니다. 그 뒤를 이어 24시간 동안 70°C에서 PEG의 100% 농도에 잠겼습니다.
100%PEG 침수 후, 70°C의 핫플레이트에 캡슐에 샘플을 넣고 플레이트가 실온에 도달할 때까지 5도 단위로 플레이트 온도를 점진적으로 감소시다. 시료가 냉각되면 마이크로톤과 일회용 블레이드를 사용하여 각 PEG 블록에서 평평한 30~60마이크로미터 두께의 섹션을 조심스럽게 얻습니다. 3 개의 5 분 부드러운 물 세차처리와 섹션에서 PEG를 제거합니다.
마지막 세척 후, 빛으로부터 보호 72 시간 동안 갓 준비 된 형광 프로브의 500 마이크로 리터와 튜브 당 최대 3 섹션배양. 스테인링 인큐베이션의 끝에서 브러시를 사용하여 섹션을 슬라이드로 옮김한 후 유리 슬라이드와 숫자 1.5H 커버 슬립 사이의 섹션을 장착합니다. sFLIM 검출기의 스펙트럼 창 폭을 결정하기 위해, 0.17 마이크로미터 유리 바닥의 배양 상자에 우레아 결정을 배치하고 현미경 샘플 홀더에 상자를 놓습니다.
900 나노미터 파장과 2%의 출력을 갖춘 20X 목표와 티타늄 도핑 사파이어 레이저를 선택하고 스캐닝을 켭니다. SFLIM 측정을 수행하려면 시스템을 SFLIM 모드로 전환합니다. sFLIM 검출기에서 제2 고조파 신호를 수집하기 위해, 제2 고조파 신호가 제2 스펙트럼 채널에서 수집될 때까지 900 에서 980 나노미터까지 레이저 발산 파장을 점진적으로 조정한다.
그런 다음 스펙트럼 창 길이를 결정합니다. 비D 스캔 모드로 전환하여 형광자를 sFLIM 검출기로 보냅니다. sFLIM 인수를 인비우기 모드로 설정하여 단일 광자 카운터에서 광자 계산을 허용합니다.
기기가 준비되면 슬라이드와 커버 슬립 사이에 제어 네이티브 밀 짚을 단독으로 배치하고 시스템을 연속 모드로 설정하여 레이저 스캔을 허용합니다. 30초 컬렉션을 설정하고 일정한 분수 구분자가 10~4번, 10회에서 6분의 1 사이인지 확인합니다. 그런 다음 샘플에서 측정 영역을 선택하고 시작을 클릭합니다.
측정이 끝나면 sdt 파일을 저장하고 최소 9개의 샘플에 대한 측정을 반복합니다. 펄스 구매를 피하면서 광자를 위해 수집된 광자를 충분히 획득하는 것과 꽃의 수명을 바꿀 수 있는 사진 유도 효과를 피하는 것 사이에서 균형을 찾아야 합니다. 상단은 획득 된 sFLIM 데이터를 분석하고, 네이티브 밀 밀 혼자 데이터 파일을 단일 광자 카운터 소프트웨어로 가져오고 옵션 및 모드를 열어 불완전한 멀티 지수 12.5 나노초를 선택합니다.
옵션 및 기본 설정에서 기악 응답 계산을 자동으로 선택하고 기하급수체 맞춤 모델을 선택합니다. 각 채널에 대해 피팅 모델을 적용하고 피트 매개 변수를 스프레드시트에 저장합니다. 채널과 실험 간의 비교를 위해 스프레드시트에서 주요 형광 수명을 계산합니다.
모든 채널에서 최소 10개의 샘플에 대한 평균 수명을 계산하려면 기증자 채널의 주요 형광 수명을 분석하여 가장 높은 광자 수를 선택하고 리그닌 최대 방출에 해당하는 전용 채널 값을 결정합니다. 대조군 네이티브 밀 짚 샘플과 실험 샘플 간의 sFLIM 및 EFRET 값을 비교하려면, FRET 이벤트로 분석될 대조군과 실험 샘플 간의 균일한 수명 감소와 관련된 양성 EFRET를 고려한다. 이 대표적인 실험에서 sFLIM 곡선은 참조 샘플과 두 상호 작용 사례 간에 달성될 수 있는 일부 수정 사항을 보여 준다.
실제로, 로다민 방출 범위에 대응하는 스펙트럼 영역의 형광 증가는 쉽게 시각화된다. 세 가지 첫 번째 채널 광자 붕괴 곡선을 주의 깊게 관찰하면 로다민으로 태그된 덱스트린이 로다민으로 태그된 토착 밀 짚에 대한 강한 변곡점을 드러냅니다. 광자 붕괴 곡선을 피팅하고 각 채널 주요 형광 수명을 계산한 후 FRET 서명이 더욱 분명해집니다.
예를 들어, 형광 수명이 대체로 증가하고 종래 의 밀 짚 샘플에 대한 형광 스펙트럼을 따라 감소하는 동안, 로다민과 로다민 샘플로 태그된 독밀 짚으로 태그된 PEG로 배양된 토착 밀 짚 섹션 모두에 대해 명확한 FRET 시그니처가 관찰됩니다. 리그노셀룰로오스 바이오매스 가수분해의 맥락에서, 이 방법은 각각의 새로운 바이오매스의 엄격한 특성화를 요구하는 다양한 바이오매스 샘플에서 효소 상호 작용 연구로 쉽게 이전될 수 있다. sFLIM은 샘플의 고정을 필요로하지 않기 때문에 동적 효소 리그닌 상호 작용 연구를위한 길을 포장하고 효소 엔지니어링 전략과 바이오 매스 사전 치료를 안내 할 가능성이 높습니다.
대부분의 시간으로, 수명 시간 측정은 펄스 적외선 레이저 소스의 사용을 필요로한다. 적절한 안전 주의 사항을 적절히 취해야 합니다.
