Lignoselülozik biyokütlede polisakkaritleri analiz eden enzimlerin aktivitesi lignin ile spesifik olmayan etkileşimlerin varlığı ile sınırlıdır. FRET analizi nano ölçekte evrim için uygun bir yaklaşımdır. Sonra tüm bölümleri elde biyokütle bağlı olarak bir meydan okuma olabilir.
Mikrotom ile kesit yaparken zaman ayırın ve nazik yıkama yapmak. Floresan yaşam süresi ve spektrum ölçümlerinin harmanlanması, lignin ve TAG molekülleri arasında kantitatif duyarlı ve kesin FRET tayininin yerinde olmasını sağlar. Bu yöntem, görsel bir gösteri ile öğrenmesi kolay çok boyutlu mikroskopi edinimi ve analizi nde örnek kesit gibi zor tekniklerin kullanımını kullanır.
Ahşap, buğday, lifler veya parçalardan bitki örnekleri hazırlamak için malzemenin yapısına zarar vermeden bir santimetre uzunluğundaki numuneleri kesmek ve herhangi bir havayı temizlemek için numuneleri vakumun altına yerleştirmek için jilet ler kullanın. Numuneleri 24 saat boyunca %30 oranında ve %50 oranında peg konsantrasyonlarında oda sıcaklığında hafif bir karıştırma ile seyreltin. Ardından 24 saat 70 santigrat derecede %100 PEG konsantrasyonuna batırıldı.
%100 PEG daldırma sonra, 70 derece santigrat hotplate üzerine kapsüller halinde örnekleri yerleştirin ve plaka oda sıcaklığına ulaşana kadar beş derece santigrat artışlarla kademeli olarak plaka sıcaklığını azaltmak. Numuneler soğuduğunda, her PEG bloğundan 30 ila 60 mikrometre kalınlığında düz kesitleri dikkatlice elde etmek için bir mikrotom ve tek kullanımlık bıçaklar kullanın. PEG'i üç beş dakikalık hafif su yıkar ile bölümlerden çıkarın.
Son yıkamadan sonra, ışıktan korunan 500 mikrolitre taze hazırlanmış floresan sonda ile tüp başına üç bölüme kadar kuluçkaya yatırın. Boyama kuluçka sonunda, bir cam slayt ve bir sayı 1.5H kapak kayma arasındaki bölümleri monte etmeden önce bir slayt için bölümleri aktarmak için bir fırça kullanın. sFLIM dedektörünün spektral pencere genişliğini belirlemek için üre kristallerini 0,17 mikrometrelik cam alt takibir kültür kutusuna yerleştirin ve kutuyu mikroskop numune tutucuya yerleştirin.
900 nanometre dalga boyu ve %2 güç ile 20X objektif ve titanyum doped safir lazer seçin ve tarama açın. sFLIM ölçümlerini gerçekleştirmek için sistemi sFLIM Modu'na geçin. SFLIM dedektöründeki ikinci harmonik sinyali toplamak için, ikinci spektral kanalda ikinci harmonik sinyal toplanana kadar lazer uyarma dalga boyunu kademeli olarak 900 ila 980 nanometreye ayarlayın.
Sonra spektral pencere uzunluğunu belirleyin. Floresan fotonları sFLIM dedektörüne göndermek için D olmayan taranan moduna geçin. SFLIM Kazanım'ı, tek foton sayacına foton sayılmasına izin vermek için Etkinleştirme Modu'na ayarlayın.
Cihaz hazır olduğunda, mikroskop aşamasına slayt ve kapak fişi arasına bir kontrol yerli buğday samanı tek başına bitki bölümü yerleştirin ve lazer tadına izin vermek için sistemi Sürekli Mod'a ayarlayın. 30 saniyelik bir koleksiyon ayarlayın ve sabit kesir ayırıcısının bir kere 10 ile dördüncü ve bir kere 10 ile altıncı arasında olup olmadığını kontrol edin. Ardından örnekteki ölçüm alanını seçin ve Başlat'ı tıklatın.
Ölçümün sonunda, sdt dosyasını kaydedin ve en az dokuz örnek için ölçümü tekrarlayın. Nabız satın alma ve floresan ömür boyu değiştirebilirsiniz fotoğraf kaynaklı etkileri kaçınarak foton için yeterli toplanan fotonelde arasında bir denge bulunmalıdır. Üst edinilen sFLIM verileri analiz, tek foton sayacı yazılımı içine yerli buğday saman tek başına veri dosyaları almak ve Eksik Multi Üslü 12,5 nanosaniye seçmek için Seçenek ve Mod açık.
Seçenekler ve Tercihler altında, Otomatik Olarak Araçsal Yanıtı Hesapla'yı seçin ve Üstel Sığdıra Model'i seçin. Her kanal için montaj modelini uygulayın ve uygun parametreleri elektronik tabloya kaydedin. Kanallar ve denemeler arasında bir karşılaştırma için bir elektronik tabloda ana floresan ömrü hesaplar.
Tüm kanallarda en az 10 örnek için ortalama ömrü hesaplamak için, en yüksek foton numarasını seçen ve lignin maksimum emisyonuna karşılık gelen özel kanal değerini belirlemek için donör kanallardaki ana floresan ömrünü analiz edin. SFLIM ve EFRET değerlerini kontrol yerli buğday saman numunesi ile deneysel bir örnek arasında karşılaştırmak için, kontrol ile deneysel numuneler arasında homojen bir yaşam boyu azalma ile ilişkili pozitif bir EFRET'i FRET olayı olarak değerlendirin. Bu temsili deneyde, sFLIM eğrileri referans örneği ve iki etkileşim örneği arasında elde edilebilen bazı değişiklikleri gösterir.
Gerçekten de Rhodamine emisyon aralığına karşılık gelen spektral bölgelerdeki floresan artışı kolayca görüntülenir. Üç ilk kanal foton çürüme eğrileri dikkatli gözlem, aynı zamanda Rhodamine ile etiketlenmiş Dextrin ile yerli buğday saman için daha güçlü bir çekim ortaya koymaktadır, Rhodamine ile etiketlenmiş yerli buğday saman için daha rhodamine ile etiketlenmiş yerli buğday saman için daha. Foton bozunma eğrileri uydurma ve her kanal ana floresan ömrü hesaplandıktan sonra, FRET imza daha belirgin hale gelir.
Örneğin, floresan ömrü alternatif olarak yerli buğday saman numunesi için floresan spektrum boyunca artar ve azalırken, PEG ile inkübe edilmiş her iki yerli buğday samanı ve Rhodamine örnekleri ile dextrin etiketli yerli buğday samanları için net bir FRET imzası görülmektedir. Lignoselülozik biyokütle hidrolizi bağlamında, bu yöntem her yeni biyokütlenin titiz bir karakterizasyonu gerektiren çeşitli biyokütle örneklerinde enzim etkileşim imelerine kolayca aktarılabilir. SFLIM numunenin fiksasyonunu gerektirmediğinden dinamik enzim lignin etkileşim çalışmalarının önünü açmakta ve enzim mühendisliği stratejilerine ve biyokütle ön tedavilere rehberlik etme olasılığı yüksektir.
Çoğu zaman olduğu gibi, yaşam süresi ölçümleri darbe kızılötesi lazer kaynaklarının kullanımını gerektirir. Buna göre uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır.
